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13 juillet 2016 3 13 /07 /juillet /2016 08:58

Alors âgée de 44 ans, Emmanuelle Gunther demande à son dentiste, à Issoudun (Indre), de lui enlever un « plombage » (amalgame dentaire) en avril 2013.


Quelques semaines plus tard, elle ressent des douleurs inexpliquées, une immense fatigue et découvre un nodule thyroïdien.


Suivront de longs mois d’errance médicale, elle sera hospitalisée dix fois.


Elle est alors convaincue que c’est l’extraction de son plombage qui est à l’origine de ses maux.


Face à des médecins qui lui disent qu’elle « somatise », elle se débat seule, fait de nombreuses recherches.


Elle était, jusqu’ici, en parfaite santé et courait une trentaine de kilomètres par semaine.


Cette jeune femme effectue des tests urinaires qui confirment ce qu’elle pensait.


Ses urines contiennent 76 fois plus de mercure que la moyenne.


Elle va alors se soigner en Suisse, où elle effectue des traitements de chélation, qui permettent d’aider le corps à « éliminer » le mercure.


Classé comme substance très toxique
Rares sont les établissements hospitaliers à le faire en France, et ce n’est pas pris en charge.


Aujourd’hui, Emmanuelle Gunther va mieux, mis à part des allergies et douleurs articulaires qui l’obligent à prendre des antalgiques.


Elle ne veut pas en rester là et envisage de porter plainte.


Son dentiste n’aurait pas suivi les recommandations de l’Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) lors de la dépose d’un amalgame.


Les professionnels doivent utiliser des séparateurs pour éviter le rejet des déchets d’amalgames, qui représentent un risque toxique élevé.


Appelés à tort plombages, les amalgames dentaires sont un mélange de poudre d’alliage métallique (argent, étain, cuivre et zinc) et de mercure liquide, à hauteur de 40 % à 50 %, qui sont encapsulés.


Classé comme substance très toxique, le mercure est considéré par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) comme « extrêmement préoccupant pour la santé publique ».


Il peut agir sur les systèmes nerveux, digestif et immunitaire, sur les poumons et les reins…


Le mercure est pointé du doigt par des patients et médecins qui accusent les amalgames dentaires d’être à l’origine de maladies auto-immunes.


Question de l’innocuité


Nombre de dentistes en France n’en posent plus en vertu du principe de précaution.


Les positions sont très tranchées.


Marie Grosman, conseillère scientifique de l’association française Non au mercure dentaire (NAMD), milite pour « son interdiction pure et simple ».


Tandis que Christian Couzinou, président de l’ordre national des chirurgiens-dentistes, écrivait début 2015 : « Le mercure est utilisé dans le monde depuis deux cents ans.


La démonstration scientifique de sa dangerosité n’a jamais été établie. »


En avril 2015, l’ANSM, dans un rapport sur l’actualisation des données du mercure des amalgames, indique certes ne pas pouvoir « établir formellement un lien entre le mercure des amalgames dentaires et les pathologies observées ».


Mais l’agence « réaffirme sa volonté de voir réduire de façon importante l’utilisation des amalgames à base de mercure dans le cadre du traitement sur la carie dentaire » et stipule qu’ils ne doivent être utilisés que s’il n’y a pas d’alternative.


La question de l’innocuité se pose aussi pour les dentistes et leurs assistantes, et tout contact avec le mercure est fortement déconseillé en cas de grossesse. Or 80 % à 90 % des assistants dentaires sont des femmes.




• Pascale Santi
Journaliste au Monde


En savoir plus sur http://www.lemonde.fr/sciences/article/2016/07/11/le-mercure-pointe-du-doigt_4967803_1650684.html#CUZJ0sqdUxgVHc2X.99

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13 juillet 2016 3 13 /07 /juillet /2016 08:57

Présents dans de nombreux objets de consommation (plastiques, cosmétiques…), les perturbateurs endocriniens peuvent interférer avec le système hormonal (endocrinien) des êtres vivants et agir à des doses d’exposition très faibles.


Ils sont soupçonnés d’augmenter de nombreuses maladies (certains cancers, diabète, obésité, troubles de l’attention, autisme) et d’agir sur la fertilité.


Le fait qu’ils altèrent l’émail des dents est beaucoup moins connu.


Le constat de la profession dentaire est unanime : les pathologies de l’émail sont de plus en plus fréquentes. « Les perturbateurs endocriniens créent des pathologies dentaires, et des matériaux utilisés peuvent contenir des substances toxiques, comme le bisphénol A (BPA) dans les composites ou le mercure dans les amalgames », explique la docteure Nathalie Ferrand, membre de Réseau environnement santé (RES) et présidente de la commission écoresponsabilité du Syndicat des femmes chirurgiens-dentistes (SFCD).


Cette lanceuse d’alerte est à l’initiative d’un colloque, « Vers une dentisterie sans perturbateurs endocriniens », organisé par RES au Sénat jeudi 23 juin.


Maladie émergente


Quasiment inexistante dans les années 1980, la MIH (hypominéralisation des molaires et des incisives), pathologie de l’émail décrite pour la première fois en 2001, peut être considérée comme une maladie émergente qui concerne 15 % à 18 % des enfants de 6 à 9 ans (âge moyen au moment du diagnostic).


La MIH se révèle par des taches opaques, blanchâtres à brunâtres, qui touchent sélectivement les premières molaires permanentes et, souvent, les incisives permanentes, les premières à minéraliser, décrit Sylvie Babajko, du Centre de recherche des Cordeliers (Inserm, universités Paris-V, Paris-VI et Paris-VII).


Ses causes sont encore peu connues mais « des faisceaux d’arguments laissent penser que les perturbateurs endocriniens y contribuent certainement, dont le BPA, les PCB et la dioxine », explique Sylvie Babajko.


La dernière partie de la vie in utero et la première année de vie sont des périodes de sensibilité maximale. « Les taux urinaires de BPA semblent plus élevés chez les enfants ayant de nombreuses dents restaurées », ajoute cette chercheuse.


« Un vrai problème de santé publique »
Le lien entre un défaut de minéralisation de l’émail et une exposition à faibles doses au BPA lors d’une période du développement a été montré pour la première fois en 2013 et publié dans la revue American Journal of Pathology en juin de la même année.


Deux groupes de seize rats mâles ont été étudiés par Katia Jedeon, du Centre de recherche des Cordeliers.


Ces animaux ont été exposés par voie orale, dès la conception, à une dose quotidienne de cinq microgrammes par jour et par kilo de poids (5 g/j/kg) de BPA, soit la dose journalière autorisée.


Au bout de trente jours, les trois quarts des rats exposés présentent des taches opaques sur les incisives, analogues au fameux MIH remarqué ces dernières années chez les enfants.


Aucun rat du groupe témoin n’a développé l’anomalie (Le Monde du 12 juin 2013).


Sensibles, parfois douloureuses et susceptibles aux caries, ces dents nécessitent un suivi particulier. « Il faut souvent dévitaliser voire couronner la dent, ou l’extraire, ce qui implique un traitement orthodontique. Conséquence : un reste à charge important », alerte Nathalie Ferrand. « Le MIH est un vrai problème de santé publique, avertit Katia Jedeon.


Les dents touchées par le MIH peuvent être soignées en utilisant des matériaux qui peuvent relarguer des monomères contenant du BPA, c’est un cercle vicieux. »


Résines, amalgames


Au-delà des pathologies dentaires, les matériaux utilisés dans les résines et composites peuvent contenir du BPA, ou les amalgames du mercure. Le dentifrice peut aussi contenir des biocides, dont le banal triclosan. Le bisphénol S, proposé en remplacement du BPA dans certains composites, doit aussi être regardé de près.


Nombre de professionnels ne sont guère informés sur ce que contiennent les matériaux mis en bouche. D’autant plus que rien n’impose aujourd’hui aux fabricants de détailler cette composition. Ces derniers restent d’ailleurs timorés. « Il faut raison garder et ne pas jeter le bébé avec l’eau du bain, dit Arnaud Pemzec, trésorier du Comité de coordination des activités dentaires.


On n’a pas aujourd’hui de matériaux de substitution.


Des grandes sociétés y travaillent depuis quatre ans. »


« Sommes-nous assez informés sur la toxicité des matériaux ? », questionne la docteure Patricia Hueber-Tardot, présidente du Syndicat des femmes chirurgiens-dentistes. « Il y a une prise de conscience de la filière dentaire, qui souhaite s’engager à réduire l’exposition de la population aux perturbateurs endocriniens, se félicite la docteure Nathalie Ferrand.


C’est une première.


Des actions concrètes ont été tuées engagées à l’issue du colloque.


Katia Jedeon a intégré la commission de la vigilance et des thérapeutiques du conseil de l’ordre des chirurgiens-dentistes.


L’idée d’un registre du MIH a été émise par la professeure Ariane Berdal, vice-doyenne de la faculté de chirurgie dentaire (Paris-VII).


Pour Sylvie Babajko, « on a une signature caractéristique d’exposition qui nous aide à cerner la dent comme un marqueur d’exposition ».


• Pascale Santi
Journaliste au Monde


En savoir plus sur http://www.lemonde.fr/sciences/article/2016/07/11/les-perturbateurs-endocriniens-alterent-l-email-dentaire_4967806_1650684.html#UUqFRePfkuCWTCpj.99

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13 juillet 2016 3 13 /07 /juillet /2016 07:55

Effet des ondes électromagnétiques Mise en garde de l'ANSES.


Les ondes électromagnétiques émises par les téléphones portables, les tablettes tactiles ou les jouets connectés peuvent avoir des effets sur les fonctions cognitives - mémoire, attention, coordination - des enfants, selon un rapport de l'Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail (Anses) publié le 8 juillet.


S'y ajoutent des effets négatifs sur le bien-être (fatigue, troubles du sommeil, stress, anxiété), attribués non aux ondes elles-mêmes mais à une utilisation intensive du téléphone portable, indique Le Parisien.


Enfin, certaines études semblent l'associer à "une santé mentale affectée", qui se traduit par des comportements à risque, de la dépression ou des idées suicidaires, relève l'Anses, qui souhaite la tenue de travaux complémentaires pour vérifier ce lien.


L'instance réitère sa recommandation de 2013 de faire un "usage modéré" des téléphones portables, de "retarder l'âge de la première utilisation" et d'appliquer à tous les dispositifs émetteurs d'ondes les "mêmes obligations réglementaires" que pour les téléphones.

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13 juillet 2016 3 13 /07 /juillet /2016 05:03

Cellules souches après un AVC : ça (re)part

12. juillet 2016

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Une patiente ayant subi un AVC qui peut marcher à nouveau après l’injection de cellules souches directement dans le cerveau, d’autres patients qui parlent mieux ou déplacent mieux leurs mains : il semblerait que nous ayons jusqu’à présent sous-estimé la capacité de régénération du cerveau.

Dans cette étude conçue sur deux ans, le groupe dirigé par Gary Steinberg, professeur de neurochirurgie à l’Université de Stanford en Californie, a réalisé une étude sur 18 participants dans le cadre de la sécurité, la faisabilité et l’efficacité de l’injection de cellules souches génétiquement modifiées. Tous ces sujets étaient des personnes qui avaient eu un AVC six mois à trois ans plus tôt et dont la rééducation avait atteint un plateau. Les résultats de l’analyse intermédiaire après 12 mois ont été publiés récemment dans la revue Stroke [Paywall].

Grâce au traitement par des cellules souches, des succès importants pourraient être obtenus selonSteinberg : « Une femme de 71 ans, qui, au début de l’étude, était seulement capable de bouger son pouce gauche peut maintenant marcher et lever son bras au-dessus de sa tête ». Des progrès significatifs ont aussi été observés chez les autres sujets. Par exemple, le score Fugl-Meyer pour déterminer la fonction motrice a été augmenté d’une moyenne de 11,4 points ; une augmentation de plus de 10 points est considérée comme cliniquement pertinente. « Les améliorations les plus importantes concernent la force, la coordination, la capacité de marcher, la possibilité d’utiliser les mains et la capacité de communiquer», dit Steinberg.

Gary Steinberg, professeur de neurochirurgie à l’Université de Stanford et directeur de l’étude sur les cellules souches (© Stanford Medicine)

Les cellules souches mésenchymateuses, une cure de jouvence pour le cerveau

Les chercheurs ont utilisé des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse de deux donneurs sains pour l’étude ouverte de phase 1/2A à un bras. Ces cellules allogéniques ont été modifiées génétiquement de sorte qu’elles expriment temporairement une partie du récepteur Notch. La voie de signalisation Notch joue en particulier un rôle important au cours du développement embryonnaire, mais également dans l’organisme adulte dans lequel, par exemple, elle régule la différentiation cellulaire.

2,5×106, 5,0×106 ou 10×106 cellules ont été implantées de manière stéréotaxique dans la région péri-infarctus chez chacun des patients. Les scientifiques ne savent pas encore exactement dans le détail ce que les cellules font à cet endroit, mais il est évident que ce n’est pas ce qu’on a toujours pensé. « L’hypothèse de départ était que les cellules souches se transforment en neurones et restaurent les circuits », a déclaré Steinberg. « Mais cela n’est certainement pas ce qui s’est passé, en particulier pour ces cellules, parce qu’il s’agit de cellules qui ont été obtenues à partir de moelle osseuse, et qui ne peuvent donc pas être transformées en neurones. Au lieu de cela, elles libèrent des facteurs de croissance et des facteurs angiogéniques très efficaces ainsi que d’autres molécules et protéines qui favorisent la plasticité. Expliqué simplement, elle transforment le cerveau adulte en un cerveau de nouveau-né, qui peut particulièrement bien récupérer d’un accident vasculaire cérébral ».

Cellules à vie courte, longue durée d’effet

Une de leurs particularités est que ces cellules souches ont apparemment une durée de vie plutôt courte : dans les modèles animaux, les cellules transplantées ne sont détectables dans le cerveau que pendant un mois. En revanche, les changements qu’ils stimulent pendant cette période semblent être durables, par exemple les effets des traitements cliniques étaient toujours observés deux ans après l’implantation (période d’observation maximale de l’étude). « Cela change toute notre conception de ce qui se passe après un accident vasculaire cérébral et de ce qui se passe après une blessure du cerveau et de la moelle épinière », dit Steinberg. « Nous avions tendance à considérer que les circuits étaient morts ou irrémédiablement endommagés après un AVC. Mais maintenant, nous devons repenser cette hypothèse. Je crois personnellement que les circuits sont inhibés, et que notre traitement aide à inverser l’inhibition. »

Mais cette thérapie n’est pas non plus sans aucun inconvénient. Tous les participants ont subi au cours de l’étude des effets indésirables qui n’étaient apparemment pas directement liés aux cellules souches. Trois participants sur quatre ont souffert de maux de tête, par exemple, qui se sont produits suite à la chirurgie. Mais globalement, il n’y eut pas d’effets secondaires graves qui rendraient le traitement difficilement utilisable. Néanmoins, d’autres études avec un plus grand nombre de participants sont nécessaires pour confirmer l’innocuité et l’efficacité de la thérapie. Steinberg a expliqué qu’une étude de phase 2b avec 156 patients avait déjà été lancée, un tiers des participants recevra comme contrôle un traitement placebo. Si les résultats sont prometteurs, il y aura un essai de phase 3.

La compétition ne dort pas

L’étude de Steinberg a été financée par SanBio, une société américaine basée en Californie qui est spécialisée dans les produits à base de cellules pour le traitement de troubles neurologiques. Toutefois, cette société n’est pas la première à être en mesure de présenter des résultats d’essais positifs avec des cellules souches injectées : l’année dernière, la société britannique ReNeuron avait annoncé avoir complété avec succès une étude de phase 1 chez 11 patients ayant subi un AVC. Les résultats de cette étude appelée PISCESont cependant été présentés uniquement lors de conférences, une publication officielle est toujours attendue. Mais, cela n’a pas dissuadé cette société de commencer une étude de phase 2 avec 21 patients.

À l’opposé, d’autres entreprises souhaitent éviter l’injection intracrânienne et essayent plutôt d’obtenir une application par voie intraveineuse. Environ 30 études correspondantes sont actuellement en cours, mais selon Steinberg, aucune n’a donné de résultats aussi remarquables que ceux des deux études dans lesquelles les cellules souches ont été implantées directement dans le cerveau. Néanmoins, il y a encore de nombreux obstacles à surmonter, ditSteinberg : « Nous avons encore beaucoup à apprendre, et entre autres quelle est la meilleure cellule pour ce travail, et quelles sont la bonne dose et la meilleure méthode d’administration. » Cependant, il est clair que cette forme de thérapie est une véritable lueur d’espoir pour les patients atteints d’AVC, une opinion partagée par Shamim Qadir de la Stroke Association britannique : « les résultats de cette étude font partie d’un ensemble de plus en plus large de données disponibles qui suggère que les thérapies par cellules souches pourraient aider à la rééducation même des mois ou des années après un accident vasculaire cérébral, ce que beaucoup de gens qui vivent actuellement avec un handicap attendent avec impatience ».

Article deAnnukka Aho-Ritter

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13 juillet 2016 3 13 /07 /juillet /2016 04:49

"La maladie de Lyme explose, c'est un scandale sanitaire"

Le professeur Christian Perronne dénonce depuis des années le déni autour de la maladie de Lyme chronique. Pour lui, et pour la centaine de médecins qui lancent dans "l'Obs" un appel à la ministre de la Santé, il faut agir. Vite.

Par Emmanuelle Anizon | Modifié à 17h22

Le professeur Christian Perronne est chef de service en infectiologie à l'hôpital universitaire Raymond-Poincaré de Garches, et codirecteur d’un groupe de travail sur la vaccination à l’Organisation mondiale de la Santé (OMS). Il est un des seuls médecins hospitaliers en France à dénoncer depuis plusieurs années l'absence de reconnaissance de la maladie de Lyme chronique.

Sous-diagnostiquée, mal prise en charge par les autorités sanitaires, cette infection, transmise par les tiques, peut amener, si elle n’est pas soignée, à la paralysie et la démence. Or, elle est en pleine expansion. "Il y a urgence", dit le professeur Perronne, qui, avec une centaine d'autres médecins, lance dans "l'Obs" un appel à la ministre de la Santé. Interview.


Christian Perronne (Bruno Coutier pour l'Obs)

Le gouvernement annonce un plan d’action national contre la maladie de Lyme. C’est une bonne nouvelle ?

Comment vous êtes-vous intéressé à la maladie de Lyme ?

Quand j’ai commencé à travailler à Garches, en 1994, j’ai vu arriver nombre de malades piqués par des tiques lors de leurs promenades dans les grandes forêts de l’Ouest parisien. Les tiques peuvent transmettre ce qu’on appelle la maladie de Lyme, due à une bactérie, la borrélie (Borrelia), elle-même souvent accompagnée d’autres bactéries et de parasites.

J’ai soigné ces malades avec trois semaines d’antibiothérapie, selon le protocole officiel, mais beaucoup rechutaient. Je voyais bien que ça ne suffisait pas. La maladie nécessite des soins plus longs. Ce que j’ai fait. J’ai découvert alors que le corps médical ne voulait absolument pas entendre parler de la chronicité de cette maladie. J’ai été moqué, jusque dans mon propre service.

Si les symptômes – articulaires, cardiologiques, neurologiques – reviennent, ce n’est plus du Lyme, on dit que c’est du "post-Lyme" et on envoie les gens en psychiatrie. C’est ahurissant ! Comme si on disait au bout de quinze jours de tuberculose : "Vous n’avez plus la tuberculose, si vous avez des signes, vous avez peut-être une dépression."

Pourquoi estimez-vous que les tests censés dépister la maladie ne sont pas efficaces ?

En plus de la borrélie responsable de la maladie de Lyme, il existe une vingtaine d’autres espèces de Borrelia. Le test Elisa, étape obligatoire pour les médecins français, n’en détecte que trois, avec de plus une proportion élevée de cas où ce test reste négatif malgré la maladie. Et pourtant, s’il est négatif, les médecins français n’ont pas le droit de poursuivre leur exploration, de compléter par un autre test plus précis, comme le Western-Blot. Même si leur patient a des signes cliniques significatifs. Les médecins peuvent être poursuivis par l’Assurance-Maladie s’ils le font !

Le centre de référence de la borréliose à Strasbourg dit encore aujourd’hui que ce test est fiable à 100%, alors que toutes les publications montrent l’inverse ! Comment peut-on continuer une telle aberration ? Surtout qu’il est prouvé depuis longtemps – ça a été publié dans les plus grandes revues scientifiques – qu’une sérologie peut être négative malgré la présence de la bactérie Borrelia.

Aux Etats-Unis, non seulement le médecin est libre de prescrire le Western-Blot malgré un Elisa négatif, mais il a même le devoir de dire à son patient qu’un test négatif, quel qu’il soit, n’est pas la preuve qu’il n’est pas infecté !

Le sujet divise la communauté médicale. Que répondez-vous aux infectiologues qui disent que Lyme est une maladie fourre-tout ?

Je suis d’accord. On ne devrait d’ailleurs pas dire "Lyme" mais "maladies vectorielles à tiques". Le Lyme et les maladies associées donnent des signes cliniques très divers, qui, en plus, peuvent ne se déclarer que des années après. D’où la complexité du diagnostic. Et la nécessité justement d’améliorer les tests !

Aujourd’hui, les patients atteints de maladies vectorielles à tiques sont renvoyés de service en service, traités pour des pathologies qui ne sont pas les leurs : fibromyalgie, sclérose en plaques, démence… Je ne vois que ça, des faux diagnostics ! Et, pendant ce temps, leurs symptômes s’aggravent. Ce sont des histoires terribles. Certains finissent par se suicider. J’ai sorti des gens de l’asile ou de leur brancard avec un traitement prolongé d’antibiotiques. Ils en étaient arrivés là parce qu’on avait nié leur pathologie. C’est un scandale sanitaire.

que le Professeur Luc Montagnier, découvreur du VIH, compare à celui du sang contaminé. Vous évoquez carrément une "épidémie" ?

Oui, la maladie explose. Les tiques ont toujours existé, on a retrouvé des borrélies dans une momie humaine congelée depuis plus de cinq mille ans. Mais les tiques sont de plus en plus nombreuses et surtout elles sont de plus en plus infectées. Les derniers chiffres américains sont très inquiétants : en quelques années, dans les Etats du Nord-Est, on a noté environ 300% d’augmentation du nombre de comtés fortement infestés.

En Europe, les données publiées dans Eurosurveillance (2011) montrent jusqu’à 350 cas pour 100.000 habitants selon les pays : les plus touchés sont la Slovénie, l’Allemagne, l’Autriche et certains pays nordiques. Une autre étude en cours basée sur le nombre de tiques infectées et la fréquence d’érythèmes migrants montre qu’un million de personnes supplémentaires sont touchées chaque année. Et, malgré cela, la France déclare 27.000 nouveaux cas par an ! C’est ridicule.

Comment expliquez-vous ce déni ?

Les raisons sont multiples, je ne veux pas parler de ce qui est hors de mon champ de médecin. Ce que je peux dire, c’est que, outre la complexité du diagnostic et du traitement, c’est un phénomène classique : en cas d’épidémie infectieuse, les autorités répugnent à reconnaître l’étendue des dégâts, et leur responsabilité. Généralement, elles s’arc-boutent, jusqu’à ce que les malades les obligent à basculer. Cela a été le cas pour le VIH.

Est-ce ce qui est en train de se passer pour Lyme ? Des malades portent plainte contre des laboratoires, un autre fait une grève de la faim et, hop, le gouvernement annonce précipitamment un plan…

Il faudra qu’il le mène avec les associations de patients, en élargissant le cercle habituel des experts médicaux. Sinon, rien ne bougera ! Par ailleurs, c’est bien de proposer de revoir les recommandations sur le traitement des formes avancées de la maladie, en saisissant la Haute Autorité de Santé (HAS), mais c’est très long et insuffisant : il est urgent de prendre des mesures plus rapides.

Quel type de mesures ?

Celles que nous décrivons dans notre appel : mettre en place des tests de diagnostic fiables. Accorder une vraie prise en charge aux malades et arrêter de poursuivre les médecins qui les soignent, créer des unités hospitalières spécialisées Lyme, et financer la recherche : jusqu’à aujourd’hui, je n’ai jamais réussi à obtenir un euro de subvention pour ce secteur !

Propos recueillis par Emmanuelle Anizon

Emmanuelle Anizon

Journaliste

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10 juillet 2016 7 10 /07 /juillet /2016 17:52

Est que L a perte de mémoire est causée par la maladie de Lyme neurologique ou le cerveau est il dévoré par des parasites?


Pour les personnes atteintes de la maladie de Lyme neurologique qui font démence, sclérose en plaques ou maladie d'Alzheimer


par Greg LeeOne


Une après-midi, j'ai entendu une de mes filles crier d'un grand cri après qu'une guêpe ai piqué son bras.
Après l'avoir prise en charge, je suis sorti avec mon équipement de combat contre les guêpe: Zapper électrique, des gants épais, chapeau, et une bouteille de laque pour les cheveux.


Vous vous demandez peut-être: «Pourquoi une pulvérisation des cheveux?"
Parceque ça colle comme de la colle sur les ailes de la guêpe afin qu'elles ne puissent pas voler et je ne veux pas de pesticides.
Une fois qu'elles ont blessé ma fille, j'en ai fait une histoire personnelle et elles doivent s'en aller!


Donc, j'avais moi contre plus d'une douzaine de guêpes. Après le zapper et la pulvérisation, je vis l'une des guêpes ramper dans une fente entre deux planches. Et puis une autre guêpe a suivi. Je regardai prudemment dans la fente et ai vu le nid. J'ai sorti le tuyau d'arrosage et ai pulvérisé ce nid jusqu'à ce qu'aucune guêpe ne soit restée. Puis j'ai tout jeté dans les égouts. Une fois le nid disparu, le reste des guêpes a reçu le message et ne revint pas.


Comment c'est d'être piqué par des guêpes en colère défendent leur nid, ça ressemble aux nématodes qui infectent le cerveau?


Tout comme un nid de guêpes qui forment des essaims, les nématodes peuvent infecter et endommager le cerveau. Dans une récente recherche publiée dans brainRecent le Dr Alan MacDonald a trouvé des vers appelés nématodes dans des échantillons de tissu cérébral d'autopsie de patients atteints de maladie de Lyme neurologique et qui ont également été diagnostiqués avec sclérose en plaques, démence, cerveau atteint de tumeurs et maladie d'Alzheimer [1].
Les bactéries de la maladie de Lyme ont été effectivement détectées chez certains des nématodes.
Semblables à la façon dont les guêpes peuvent se cacher dans leur nid, les bactéries de Lyme peuvent se protéger des traitement antibiotique quand elles sont à l'intérieur des vers parasites plus grands. Malheureusement, les nématodes ont également été détectés dans les tiques.


Dans les tiques du chevreuil les nématodes ont été détectés dans de multiples études de tiques, les nématodes ont été détectés dans les Lone Star tiques trouvés dans le Maryland [2] et la Virginie [3], et les tiques du chevreuil du Connecticut [4].


Les Tiques sont capables de transmettre des nématodes quand ils se nourrissent sur un hôte [5].


D'autres vecteurs peuvent transmettre les nématodes : ce sont les moustiques et les mouches noires [6].


Une fois qu'ils infectent un hôte, les nématodes adultes s'accouplent puis libèrent des milliers de très petite larve appelée "microfilaires" dans le sang.
Les microfilaires circulent à travers l'hôte et peuvent se retrouver dans le système nerveux [7].


Ces microfilaires se transforment en larves qui peuvent manger le cerveau et peuvent causer un large éventail de symptômes.


Les nématodes produisent beaucoup de symptômes quand ils infectent le cerveau et Le liquide céphalo-rachidien. les nématodes peuvent endommager les tissus et produisent des masses appelées granulomes.


Ils peuvent aussi causer de la fibrose, des blocages dans les vaisseaux sanguins cérébraux, ou une inflammation résultat de la méningite, d'une encéphalite ou d'une inflammation localisée [8], Apparaissent la faiblesse, la vision brouillée, la "grippe de l'estomac" [9], et même la mort.


Dans une étude à Taiwan, les patients infectés par les nématodes ont déclaré de méningite, une inflammation du cerveau, et de la fièvre, des vomissements, des maux de tête, et de la neuropathie.


Deux patients sont décédés de leur infection. Chez certains patients, les nématodes ont été récupérés dans leur liquide céphalo-rachidien (LCR). Des niveaux élevés de marqueurs de l'inflammation vasculaire : endothélial growth factor (VEGF), facteur de croissance des hépatocytes (HGF) et une métalloprotéinase de La matrice 9 (MMP-9) ont également été détectés dans le LCR de fluide du patient [10].


La recherche montre que les nématodes peuvent également manipuler la réponse du système immunitaire.


Les nématodes produisent des composés pour dévier la façon dont le système immunitaire les attaque. L'étude parasitesOne sur un nématode appelé B. Malayi, montre des protéines identifiées qu'il libère pour manipuler la réponse immunitaire contre une infection parasitaire [11].


Une autre étude sur une infection par les nématodes filariens a montré comment ces parasites inhibent la réponse inflammatoire du système immunitaire [12].


Dans la plupart des cas, les médicaments anti-parasitaires sont utilisés pour traiter les infections par les nématodes dans le système nerveux.


Les médicaments anti-parasitaires aident à tuer les infections par nématodes dans le cerveau et les médicaments anti-parasitaires du LCR dans la colonne vertébrale, appelés antihelminthiques, sont utilisés pour traiter les nématodes dans le système nerveux, y compris: Mebendazole, pyrantel pamoate, Thiabendazole, diéthylcarbamazine (DEC), l'ivermectine [13], la moxidectine [14] et Alinia [15]. Ivermectine et moxidectine qui sont les médicaments antihelminthiques plus largement administrés pour les infections à nématodes et malheureusement, leur utilisation répandue et fréquente a conduit à un niveau élevé de résistance pour ces médicaments [16].


L'ivermectine ne tue pas les microfilaires, et pas le nématode adulte [17].


Le traitement par DEC peut aggraver les infections à nématodes oculaires : l'onchocercose.


Chez les patients atteints d'une infection par ces nématodes appelés Loa Loa, les DEC peuvent provoquer des réactions indésirables graves, y compris l'encéphalopathie et la mort, en fonction de la densité des parasites.


Le traitement DEC n'est disponible uniquement qu'aux États-Unis via le CDC et sur la présentation des résultats de laboratoire positifs [18].


Le mécanisme de ce médicament contre les nématodes est appelé «pompe à effux de drogue» qui est censé ne pas permettre à ces parasites de développer une résistance aux médicaments [19].


Pour les nématodes les Tuer peut conduire à des réactions d'Herxheimer importantes.


Les bactéries symbiotiques au sein des nématodes son la source d'Herxheimer


Wolbachia est une bactérie symbiotique qui permet le développement normal et la fertilité des nématodes [20].


Wolbachia appartient à l'ordre des Rickettsies et est étroitement liée à Anaplasma, Ehrlichia et Rickettsia [21].


Heureusement, cette bactérie n'infectent pas les gens.


Lorsque les nématodes sont tuées par des médicaments anti-parasitaires, Wolbachia ne peut pas survivre sans leur hôte et sont tués, ce qui libère leurs endotoxines.


Les toxines de Wolbachia stimulent la production de composés pro-inflammatoires, y compris le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF) -alpha, l'interleukine-1 (IL-1), et l'interleukine-12 (IL-12) [22].


Dans une étude sur des animaux, la protéine de surface de Wolbachia est régulée à la hausse (IL) -1beta, l'IL-6 et le facteur de nécrose des tumeurs [23]. Ces endotoxines et les composés inflammatoires peuvent produire des symptômes douloureux associés à une réaction de Herxheimer.


Une combinaison de médicaments anti-parasitaires et antibiotiques est plus efficace pour réduire les adultes et les microfilaires formes de nématodes.


Une combinaison de médicaments qui tuent à la fois les formes adultes et microfilaires est la stratégie la plus efficace


Plus récemment les traitements combinent ivermectine pour les microfilaires et doxycycline pour tuer Wolbachia qui finit par tuer les nématodes adultes dans le système nerveux.


Ce traitement de combinaison de médicaments est recommandé pendant six semaines [24].


Une autre étude animale a combiné DEC liposomale et doxycycline et liposomale rifampine résultant en une augmentation significative de la mort des microfilaires et une augmentation marginale de la population hors nématodes adultes [25].


D'autres études démontrent l'effet inhibiteur des antibiotiques anti-Rickettsia comme la tétracycline, la rifampicine, et azithromyacin sur les nématodes adultes [26].


Qu'est ce qui peut aider les gens à expulser les nématodes du cerveau-mangeurs de leur système nerveux central qui ont une maladie neurologique persistante de Lyme, la sclérose en plaques, la démence, les tumeurs cérébrales, ou la maladie d'Alzheimer?


Voici quatre stratégies pour expulser les nématodes mangeurs du cerveau : la combinaison pour désinfecter le système nerveux central par des voies de recours pour attaquer à la fois aux formes adultes et aux microfilaires est le système le plus efficace pour réduire le nombre total de parasites.


Formuler des remèdes en microparticules appelées liposomes améliore l'efficacité des herbes anti-parasitaires et huiles essentielles pour tuer les différentes étapes de la vie des nématodes [27] et, éventuellement, leurs bactéries symbiotiques.


Stratégie Nématodes Clearing Brain-alimentaire # 1: les huiles essentielles ont prouvé leur efficacité pour inhiber différentes espèces de nématodes.


Le Thym en huile essentielle était efficace pour inhiber Meloydogine javanica [28] et les larves du nématode Anisakis [29].


L'huile essentielle de thym est également efficace contre les bactéries à Gram négatif Pseudomonas aeruginosa [30], Salmonella spp [31] et E. coli [32]..


Le Thym associé à l'huile d'origan réduit les cytokines pro-inflammatoires IL-1beta, IL-6, GM-CSF, et TNFalpha [33].


Palmarosa huile essentielle était efficace contre Caenorhabditis elegans [34] et Haemonchus contortus [35] dans des études séparées.


Cette huile est également efficace pour inhiber E. Coli [36] et Aspergillus fumigatus [37]. l'huile de palmarosa a également réduit les composés pro-inflammatoires TNF-a, IL-1 et IL-8 [38] et l'augmentation de l'anti-inflammatoire IL-10 dans des études de laboratoire [39].


Le Clou de girofle bourgeon huile essentielle a été très efficace à réduire [40] Meloidogyne incognita et l'éclosion des œufs de 50% et de tuer les juvéniles en deuxième étape (J2), autant que 100% dans une étude de laboratoire [41]. Eugénol, le composé primaire dans de l'huile de clou de girofle, dans une étude de rat réduit l'expression de VEGF, MMP-2 et MMP-9 [42], qui sont élevés dans les infections de nématodes.


Le traitement de ces huiles dans une forme micronisée liposomale augmente leur pénétration dans le système nerveux [43].


L'ajout de nanoparticules d'argent aux huiles liposomiques peut encore améliorer leurs propriétés anti-microbiennes.


stratégie d'attaque des Nématodes Brain-manger # 2:


Nanoparticules d'argent: Les études de laboratoire multiples, montrent que des nanoparticules d'argent ont été efficaces pour réduire la motilité et de tuer les microfilaires de Brugia malayi [44], et a démontré une activité antifilarienne contre les microfilaires de S. Cervi [45], elles ont perturbé le métabolisme de Caenorhabditis elegans [46], et tué la plupart des Meloidogyne incognita [47].


Encapsuler des nanoparticules d'argent ainsi que des huiles essentielles dans un remède liposomale peut augmenter leurs propriétés anti-bactériennes et anti-parasitaires symbiotiques.


Lorsque les nanoparticule d'argent sont combinées avec de l'huile essentielle d'arbre à thé dans un liposome, leur efficacité antimicrobienne est renforcée contre le Pseudomonas aeruginosa, le Staphylococcus aureus et le Candida albicans [48]. Les nanoparticules d'argent peuvent réduire l'inflammation par nématodes en inhibant l'IL-1beta et le VEGF avec perméabilité induite comme rapporté dans une étude sur le porc [49] et la réduction de la MMP-2 et MMP-9 dans une autre étude chez le rat [50].


Les herbes ont également été efficaces pour traiter les infections à nématodes depuis des milliers d'années.


Autre stratégie Nématodes Brain-Eating # 3:
ajout de HerbsIn aux huiles et argent essentielles, herbes ont été utilisés depuis des siècles pour lutter contre les infections de nématodes.


Andrographis, nom chinois Chuan Xin Lian, a été efficace pour inhiber Haemonchus contortus [51], l'activité microfilaricide contre Dirofilaria immitis filarids [52], l'activité antifilarien contre les vers adultes de subpériodique Brugia malayi [53], tuant in vitro les microfilaires de Dipetalonema reconditum chez les chiens [54], et une activité anthelminthique contre Ascaris lumbricoides [55].


Cette herbe est également utilisée dans la médecine chinoise contre la leptospirose, une autre infection à spirochète [56].


L'Andrographis a également été efficace pour réduire les composés inflammatoires IL-1alpha, l'IL-1ß et IL-6 dans une étude de laboratoire [57].


Le Composé actif de Andrographis appelé andrographolide inhibe l'expression de composés inflammatoires MMP-2, l'IL-1 bêta [58] et le VEGF [59] dans des études de laboratoire.


L'Ajowan, ajowan ou Trachyspermum ammi a été efficace contre plusieurs espèces de nématodes dans plusieurs études. extrait méthanolique des fruits de Trachyspermum ammi étaient efficaces contre les bovins filariens infectés par des vers Setaria digitata et il a été démontré une activité macrofilaricide et stérilisante de la femelle du ver in vivo contre B. Malayi [60].


Le Lantana camara est un arbuste ornemental qui est très robuste et est utilisé en médecine à travers une grande partie du monde.


Cette plante contient des triterpénoïdes d'acide pomolic, acide lantanolic, acide lantoic, Camarín, lantacin, camarinin, et l'acide ursolique qui entrainaient une mortalité de 100% en 24 - 48 heures contre le nématode Meloidogyne incognita [61].


Dans d'autres études, un extrait de lantana tué adultes Brugia malayi nématodes et stérilisée bon nombre des survivants vers femelles, et a démontré une forte microfilaricide et efficacité de la stérilisation avec une action macrofilaricide légère contre Acanthocheilonema viteae [62].


Non seulement les herbes, mais aussi de petites fréquences électriques peuvent aider à arrêter les nématodes qui ont infecté le cerveau et le liquide rachidien.


La Stratégie Nématodes Clearing Brain-Eating # 4:


Fréquence MicrocurrentFrequency spécifique microcourants spécifique utilise millionième d'un ampli de courants électriques pour réduire les infections parasitaires et bactériennes, les toxines et l'inflammation [63].


Fréquences pour inhiber les vers parasites, les bactéries symbiotiques, neutraliser les toxines et l'inflammation, ce qui réduit les tumeurs, et la promotion de la guérison sont jumelés avec des fréquences pour cibler les zones infectées du système nerveux: le cerveau, le cerveau antérieur, les méninges, le ganglion basal, la moelle épinière, le liquide rachidien, crânien les nerfs et les yeux [64].


Ces fréquences appariées ont également été utiles pour réduire les symptômes chez les patients atteints de sclérose en plaques, l'autisme, l'inflammation du cerveau, de la toxicité du moule et la maladie de Lyme neurologique.


Ces quatre stratégies peuvent aider les personnes aux atteintes neurologiques de type Lyme pour arrêter une infection parasitaire sous-jacente des nématodes au niveau du cerveau.


Une combinaison de remèdes et des traitements anti-parasitaires peuvent aider à surmonter une infection de Lyme chronique et avec nématodes entraînant des troubles neurologiques diagnostiqués comme sclérose en plaques, maladie d'Alzheimer, démence, ou tumeurs cérébrales peuvent avoir caché les nématodes parasites ainsi que la maladie de Lyme dans leur système nerveux.


Tout comme la recherche et l'élimination du nid de guêpe, expulsant les nématodes parasites qui abritent des bactéries de Lyme peuvent aider à améliorer les symptômes neurologiques et le rappel de mémoire.


Utilisation liposomales de bactéries anti-parasitaires et anti-symbiotiques et traitements qui peuvent être efficaces pour éliminer les parasites plus grands et la bactérie de Lyme qu'ils contiennent.


Les traitements anti-toxines et les remèdes peuvent également aider à réduire les composés inflammatoires qui peuvent réduire la douleur toxique d'Herxheimer et l'inconfort que cela entraîne


La réalisation de ces remèdes dans des liposomes micronisées améliore leur livraison dans le système nerveux et peut accroître leur efficacité anti-nématode.


Comme certains de ces traitements et des remèdes exigent une formation spécialisée, le travail du remède naturel doit se faire avec un praticien connaissant la maladie de Lyme pour élaborer une stratégie appropriée, sûre et efficace contre la maladie.


Prochaine étape: Rendez-vous à comment se débarrasser de la maladie de Lyme Diseaseevening conférence le lundi 11 Juillet à 18 heures à Frederick, Maryland pour en savoir plus sur les huiles essentielles, des herbes et des traitements pour la guérison des symptômes de la maladie de Lyme et la co-infection.
http://goodbyelyme.com/events/get_rid_lyme


Découvrez également des remèdes et des traitements efficaces pour soulager les symptômes persistants de Lyme et les co-infections, y compris: laser froid, Fréquence microcourants spécifique, les ventouses, la thérapie LED, moxabustion, l'acupuncture, les herbes liposomales, les huiles essentielles, le venin d'abeille, et plus encore!


Post-scriptum Avez-vous des expériences où des remèdes ou des traitements vous ont aidé à surmonter les problèmes de mémoire causées par des parasites du cerveau-manger ou une infection de la maladie de Lyme? Dis nous à propos de cela.


par Greg le 8 Juillet, 2016


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Published by Jean-Pierre LABLANCHY - CHRONIMED - dans Infections froides
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9 juillet 2016 6 09 /07 /juillet /2016 08:06

A Landscape of Pharmacogenomic Interactions in Cancer


Francesco Iorio20, Theo A. Knijnenburg20, Daniel J. Vis20, Graham R. Bignell20, Michael P. Menden20, Michael Schubert, Nanne Aben, Emanuel Gonçalves, Syd Barthorpe, Howard Lightfoot, Thomas Cokelaer17, Patricia Greninger, Ewald van Dyk, Han Chang, Heshani de Silva, Holger Heyn, Xianming Deng18, Regina K. Egan, Qingsong Liu, Tatiana Mironenko, Xeni Mitropoulos, Laura Richardson, Jinhua Wang, Tinghu Zhang, Sebastian Moran, Sergi Sayols19, Maryam Soleimani, David Tamborero, Nuria Lopez-Bigas, Petra Ross-Macdonald, Manel Esteller, Nathanael S. Gray, Daniel A. Haber, Michael R. Stratton, Cyril H. Benes, Lodewyk F.A. Wessels21, Julio Saez-Rodriguez21, Ultan McDermott21,
, Mathew J. Garnett21,
17Present address: Bioinformatics and Biostatistics Hub, C3BI, USR 3756 IP CNRS, Institut Pasteur, 75015 Paris, France
18Present address: Innovation Center for Cell Signaling Network, School of Life Sciences, Xiamen University, 361102 Xiamen, China
19Present address: Institute of Molecular Biology, Mainz 55128, Germany
20Co-first author
21Co-senior author
Publication stage: In Press Corrected Proof
Open Access
DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.06.017


Cancers arise because of the acquisition of somatic alterations in their genomes that alter the function of key cancer genes (Stratton et al., 2009). A number of these alterations are implicated as determinants of treatment response in the clinic (Chapman et al., 2011, Mok et al., 2009, Shaw et al., 2013). Studies from The Cancer Genome Atlas (TCGA) and the International Cancer Genome Consortium (ICGC) have generated comprehensive catalogs of the cancer genes involved in tumorigenesis across a broad range of cancer types (Lawrence et al., 2014, Tamborero et al., 2013b, Zack et al., 2013). The emerging landscape of oncogenic alterations in cancer points to a hierarchy of likely functional processes and pathways that may guide the future treatment of patients (Ciriello et al., 2013, Hanahan and Weinberg, 2000, Stratton et al., 2009).
Clinical trials are complex and expensive, and pre-clinical data that helps stratify patients can dramatically increase the likelihood of success during clinical development (Cook et al., 2014, Nelson et al., 2015). Thus, pre-clinical biological models that, as much as reasonably possible, capture both the molecular features of cancer and the diversity of therapeutic responses are a necessity. Human cancer cell lines are a facile experimental model and are widely used for drug development. Large-scale drug sensitivity screens in cancer cell lines have been used to identify clinically meaningful gene-drug interactions (Barretina et al., 2012, Basu et al., 2013, Garnett et al., 2012, Seashore-Ludlow et al., 2015). In the past, such screens have labored under the limitation of an imperfect understanding of the landscape of cancer driver genes, but it is now possible to view drug sensitivity in such models through the lens of clinically relevant oncogenic alterations.


Here, we analyzed somatic mutations, copy number alterations, and hypermethylation across a total of 11,289 tumor samples from 29 tumor types to define a clinically relevant catalog of recurrent mutated cancer genes, focal amplifications/deletions, and methylated gene promoters (Figure 1A; Tables S1A–S1D). These oncogenic alterations were investigated as possible predictors of differential drug sensitivity across 1,001 cancer cell lines (Figures 1B and 1C; Table S1E) screened with 265 anti-cancer compounds (Figures 1D and S1; Table S1F). We have carried out an exploration of these data to determine (1) the extent to which cancer cell lines recapitulate oncogenic alterations in primary tumors, (2) which oncogenic alterations associate with drug sensitivity, (3) whether logic combinations of multiple alterations better explain drug sensitivity, and (4) the relative contribution of different molecular data types, either individually or in combination, in predicting drug response (Figure 1E).




Results
Oncogenic Alterations in Human Tumors
We built a comprehensive map of the oncogenic alterations in human tumors using data from TCGA, ICGC, and other studies (Figure 1A; Table S1C). The map consisted of (1) cancer genes (CGs) for which the mutation pattern in whole-exome sequencing (WES) data is consistent with positive selection, 2) focal recurrently aberrant copy number segments (RACSs) from SNP6 array profiles, and 3) hypermethylated informative 5′C-phosphate-G-3′ sites in gene promoters (iCpGs) from DNA methylation data, hereafter collectively referred to as “Cancer functional events” (CFEs). We identified CFEs by combining data across all tumors (pan-cancer), as well as for each cancer type (cancer specific) (Tables S2A, S2D, and S2H).
The WES dataset consisted of somatic variant calls from 48 studies of matched tumor-normal samples, comprising 6,815 samples and spanning 28 cancer types (Tables S1A–S1D). CGs were detected per cancer type by combining the outputs of three algorithms: MutSigCV, OncodriveFM, and OncodriveCLUST (Lawrence et al., 2013, Rubio-Perez et al., 2015, Tamborero et al., 2013a). This identified 461 unique pan-cancer genes (Table S2A). We further added nine genes identified as putative tumor suppressors (Wong et al., 2014). We mined the COSMIC database to identify likely driver mutations in 358 of the 470 CGs (Table S2B; Supplemental Experimental Procedures). Most tumors harbored only a few driver mutations (median n = 2, range 0–64), consistent with previous reports (Kandoth et al., 2013, Vogelstein et al., 2013).
RACSs were identified using ADMIRE for the analysis of 8,239 copy number arrays spanning 27 cancer types (van Dyk et al., 2013) (Table S1D; Supplemental Experimental Procedures). In total, 851 cancer-specific RACSs were gained (286 segments) or lost (565 segments), with a median of 19 RACSs per tumor type (Table S2D). The median number of genes within each RACS was 15 for amplified regions and one for deleted regions. The majority of known driver gene amplifications (e.g., EGFR, ERBB2, MET, and MYC) and homozygous deletions (e.g., CDKN2A, PTEN, and RB1) were captured, with 320 RACSs (38%) containing at least one known putative cancer driver gene, in addition to 531 RACSs (62%) without known driver genes. A smaller pan-cancer set (due to overlap in RACSs across cancer types) was constructed by pooling these results, comprising 425 RACSs (117 amplified and 308 deleted) (Tables S2D–S2F).
iCpGs were identified using DNA methylation array data for 6,166 tumor samples spanning 21 cancer types (Table S1D). We defined 378 iCpGs based on a multimodal distribution of their methylation signal in at least one cancer type (Tables S2H and S2I). This also established a discretization threshold used to define such regions as hyper-methylated in the cell lines (Table S2J; Supplemental Experimental Procedures).
In total, our multidimensional analysis of >11,000 patient tumor samples identified 1,699 cancer-specific CFEs, which were further merged into 1,273 unique pan-cancer CFEs (Figure S2A).


Oncogenic Alterations in Patient Tumors Are Conserved across Cell Lines
Next, we assessed the extent to which the mutational landscape of cancer cell lines captures that seen in primary tumors. We utilized a panel of 1,001 human cancer cell lines analyzed through WES (n = 1,001), copy number (n = 996), gene expression (n = 968), and DNA methylation (n = 957) (http://cancer.sanger.ac.uk/cell_lines) (Figure 1B) and which we reclassified according to the TCGA tissue labels (Figure 2A; Tables S1A and S1E). Molecular alterations identified in cell lines were filtered using the CFEs identified in the primary tumor samples, providing a set of clinically relevant CFEs for the cell lines (Figure 1C).


Of the 1,273 pan-cancer CFEs identified in patient tumors, 1,063 (84%) occurred in at least one cell line, and 1,002 (79%) occurred in at least three (Figure 2A). This concordance was greatest for the RACSs (100% of 425; Table S2G), followed by iCpGs (338 of 378, 89%; Table S2J) and CGs (300 of 470, 64%; Table S2C). When considering cancer-specific CFEs, concordance was highest for CFEs occurring in at least 5% of patients (median of 86% of CFEs covered across cancer types; Figure 2A; Data S1A). Coverage of CFEs varied by cancer type, and when we include infrequent CFEs (occurring in < 5% of patients), this concordance is markedly lower for the majority of cancer types (median coverage = 46%; Figure S2B). CFEs absent in cell lines are reported in Table S2K.
The correlation between the frequency of CFEs in cell lines and patient tumors was high for the majority of the cancer types and for all three classes of CFEs (Figures 2B and S2C; Table S2L; Supplemental Experimental Procedures). Using a simple nearest-neighbor classifier based on the presence of CFEs in cell lines and tumors across cancer types, we could correctly match the tissue of origin of cell lines to primary tumors (and vice versa) for 71% of the cases (27 out of 38 alteration profiles [randomly expected 1%]) (Figures S2D and S2E; Table S2M; Supplemental Experimental Procedures). This percentage increased to 81% and 92% (randomly expected 2% and 5%), when considering the second and fifth nearest-neighbors, respectively (Figure S2E).
The frequency of alterations in 13 canonical cancer-associated pathways was highly correlated between cell lines and tumors of the same cancer type (median R = 0.75 across all 13 pathways) (Figure 3A; Table S3A).


A previous hierarchical classification of ∼3,000 tumors identified two major subclasses: M and C class (dominated by mutations and copy number alterations, respectively) (Ciriello et al., 2013). We expanded this analysis by including methylation data and by jointly analyzing cell lines and tumor samples. This integrated analysis of 3,673 samples (composed of 1,001 cell lines and 2,672 primary tumors for which all three data types were available and that were positive for at least one of the 1,250 CFEs [Tables S3B and S3C]) yielded four classes referred to as M, H, CD, and CA (Table S3D; Supplemental Experimental Procedures). Class M is enriched for CG mutations, class H for hypermethylation of iCpGs, and classes CD and CA for deleted and amplified RACSs, respectively (Figures 3B and S3; Tables S3E, S3F, and S3H; Data S1B). We observed a high concordance between the predominant class of CFEs in primary tumors and cell lines of the same tissue type (80% of cancer types, exceptions being GBM, KIRC, and PRAD) (Figure 3C; Table S3G; Data S1B).


Taken together, these results show that a sufficiently large panel of cell lines is able to capture individual clinically relevant genomic alterations, in addition to pathway alterations and global signatures of driver events.
A Therapeutic Landscape of Human Cancers
Modeling Pharmacogenomic Interactions
To investigate how CFEs detected in primary tumors impact drug response, we first mapped these on our panel of cell lines (Figure 1C; Tables S2C, S2G, and S2J). Cell lines underwent extensive drug sensitivity profiling, screening 265 drugs across 990 cancer cell lines and generating 212,774 dose response curves (median number of screened cell lines per drug = 878, range = [366, 935]; Figure 1D). This is an expansion on previous pharmacogenomic datasets (Barretina et al., 2012, Basu et al., 2013, Garnett et al., 2012, Seashore-Ludlow et al., 2015). The effect of each drug on cell number was used to model sensitivity as IC50 (drug concentration that reduces viability by 50%) or AUC (area under the dose-response curve) values (Tables S4A and S4B).
Screened compounds included cytotoxics (n = 19) and targeted agents (n = 242) selected against 20 key pathways and cellular processes in cancer biology (Figure 1D; Table S1F). These 265 compounds include clinical drugs (n = 48), drugs currently in clinical development (n = 76), and experimental compounds (n = 141). We screened seven compounds as biological replicates and observed good correlation between replicate IC50 values with a median Pearson correlation (R) = 0.65 (0.78 for the compounds with most of IC50 values falling within the range of tested concentrations) and consistent classification of cell lines as sensitive or resistant to a compound (median Fisher’s exact test [FET] log10 p value = −26) (Figure S1). Cluster analysis based on AUC values confirmed that compounds with overlapping nominal targets or targeting the same process/pathway had similar activity profiles (Table S1G; Supplemental Experimental Procedures).
We used three distinct analytical frameworks to define the contribution of CFEs to the prediction of drug sensitivity (Figure 1E). ANOVA was used to identify single CFEs as markers of drug response. Logic models identified combinations of CFEs that improve the prediction of drug response. Lastly, we used machine-learning algorithms to assess the contribution of each molecular data type (CGs, RACS, iCpGs, and gene expression) in explaining variation in drug response. For consistency, all analyses used IC50 values. We carried out a pan-cancer, as well as a cancer-specific, analysis (for those 18 cancer types of sufficient sample size, n > 15 cell lines).
ANOVA Analysis Defines a Landscape of Pharmacogenomic Interactions
For pan-cancer ANOVA, the set of CFEs included 267 CGs, 407 RACSs, and three gene fusions (BCR-ABL, EWSR1-FLI1, and EWSR1-X). Overall, for the 265 compounds, we identified 688 statistically significant interactions between unique CFE-drug pairs (p value < 10−3at a false discovery rate [FDR] < 25%; Figure 4A), with 540 pan-cancer and 174 cancer-specific hits (Figure S4A; Table S4C). A subset of 262 CFE-drug pairs was additionally defined as large-effect interactions (Figure 4A). The effect size was quantified through Glass deltas (Δs) and Cohen’s D (CD) (Supplemental Experimental Procedures).




The majority of CFE-drug interactions was exclusively identified in either the pan-cancer or cancer-specific analysis (n = 662 of 688 significant interactions, 96%, and n = 254 of 262 significant large-effect interactions, 97%), with few overlapping interactions (Figure 4A; Table S4C). The effect size was frequently greater for the cancer-specific associations than for pan-cancer associations (CD > 1 for 100% and 30% of hits, respectively) (Table S4D). A possible explanation for this observation could be that cancer-specific associations, with fewer cell lines, require a larger effect size to be statistically significant. However, downsampled pan-cancer analyses confirmed that the increased effect size of cancer-specific associations is greater than expected by downsampling alone (Figures S4B and S4C; Supplemental Experimental Procedures). This indicates that sensitivity to many drugs is modulated by genomic alterations in the context of a defined tissue lineage.
Overall, 233 of 674 (34%) CFEs were significantly associated with the response to at least one compound, and more RACSs (62%) were associated with response than were CGs (38%). The importance of these two classes of CFEs varied by cancer type and was related to their prevalence (Figures 3C and S4G).
We identified significant associations for the majority of compounds (85%; n = 225 of 265). When compounds were classified by their nominal target into 20 specific biological processes (Figure S4H; Table S1F), CFEs best explained sensitivity to compounds targeting EGFR and ABL signaling, mitosis, and DNA replication and least explained sensitivity to compounds targeting TOR, IGF1R, and WNT signaling. For the latter, alternative non-genomic events may be the primary modulators of drug sensitivity. The proportion of cytotoxic and targeted compounds (Table S1F) associated with at least one significant large-effect interaction was similar (63% and 60%, respectively). However, compared to targeted agents, the significant interactions between CFEs and cytotoxics tended to be of a smaller effect size (average CD 0.96 vs. 1.32) and less significant (average –log10 p value 3.68 vs. 4.56).
We performed ANOVA on randomly downsampled subsets of cell lines (500, 300, 150, and 60 cell lines) and evaluated our ability to retain the set of statistically significant associations. The number of associations exponentially decreased as the number of cell lines was reduced, with a loss of ∼80% of pan-cancer associations when using 500 cell lines (Figures S4D–S4F; Supplemental Experimental Procedures). This highlights the utility of using a large cell line collection to increase statistical power and to preserve representation of diverse genotypes and histologies.
ANOVA Identifies Known and Novel Gene-Drug Associations
Among the individual CFE-drug associations, we identified many well-described pharmacogenomics relationships (Figure 4B). These included clinically relevant associations between alterations in BRAF, ERBB2, EGFR, and the BCR-ABL fusion gene and sensitivity to clinically approved drugs in defined tumor types, as well as associations between KRAS, PDGFR, PIK3CA, PTEN, CDKN2A, NRAS, TP53, and FLT3 with drugs that target their respective protein products or pathways (Figure 4B; Table S4C). Moreover, we observed a secondary T790M EGFR mutation in lung adenocarcinoma (LUAD) and resistance to EGFR-targeted therapies (Gefitinib and Afatinib) (Godin-Heymann et al., 2008) (Figure 4D), as well as resistance of NRAS mutated melanoma patients to a BRAF inhibitor (Figure 4B; Table S4C) (Su et al., 2012).
A pathway-centric view highlighted the number of interactions between CFEs in cancer pathways (EGFR, ERK-MAPK, PI3K-MTOR, and DNA repair and cell-cycle-related pathways) and drugs targeting those CFEs (Figure S4I). For example, compounds targeting EGFR signaling showed potent activity in cells with EGFR and ERBB2 alterations, but were ineffective in cells with downstream alterations in ERK-MAPK signaling, such as mutant RAS.
To explore the most important CFE-drug interactions, we focused on 262 associations with a large effect on drug sensitivity (p < 10−3, FDR < 25%, and Δ > 1, for both the cell line populations included in the test) (Figure 4C; Table S4C). For example, at the pan-cancer level, U2AF1 mutations associate with sensitivity to multiple FLT3 inhibitors, such as AC220 (p = 8.3 × 10−8, CD = 2.5), Sorafenib (p = 3.04 × 10−6, CD = 2.8), Sunitinib (p = 5.6 × 10−5, CD = 2.5), and XL-184 (p = 1.3 × 10−4, CD = 1.9); PTEN mutations associate with sensitivity to an AKT inhibitor in COAD/READ (p = 3.5 × 10−6, CD = 2.4). The chemotherapeutic Mitomycin C is widely used to treat BLCA, and here, we detect, in the BLCA specific analysis, a sensitizing interaction with mutations in TP53 (p = 9.9 × 10−5, CD = 2.8) that are highly prevalent in this cancer type. In LUSC cells, loss-of-function mutations in the DNA methyltransferase MLL2 are associated with sensitivity to the clinical anti-androgen Bicalutamide (p = 6.02 ∼ 10−4, CD = 3); the BCL-2 inhibitor, ABT-263, shows activity in COAD/READ cells that harbor focal amplifications of MET (p = 1.02 × 10−4, CD = 2.8) or FOXA1/CRNKL1 (p = 1.31 × 10−4, CD = 2.2), events found in almost 60% of colorectal tumors; and truncating mutations in the co-repressor of BCL6, BCOR, statistically interact (p = 2.04 × 10−5, CD = 3.5) with sensitivity to a PKC beta inhibitor in STAD (Figure 4D), and deletions of a RACS (2q37.3) containing MTERFD2 and SNED1 is associated with resistance to the HDAC inhibitor Vorinostat (p = 5.4 × 10−7, CD = 4; Figure 4D) in OV cell lines.
Interestingly, 24 of the 262 associations are driven by RACSs that do not contain known cancer genes (Tables S4C and S2D). For these regions, the patterns of drug sensitivity may give clues as to the likely contained driver cancer gene(s).
Logic Formulas of Drug Response Refine Pharmacogenomic Modeling
Many genomic alterations occur together or in a mutually exclusive way that suggests a biological function (Babur et al., 2015). We hypothesized that combinations of CFEs could, in some contexts, improve our ability to explain variation in drug sensitivity. We employed a computational approach termed “logic optimization for binary input to continuous output” (LOBICO) to find the optimal logic model combining CFEs to explain the IC50 values for a drug, for example, “if RAS or RAF mutated, then sensitive to MEK inhibition” (Knijnenburg et al., 2016). LOBICO binarizes the IC50s, labeling cell lines as sensitive or resistant, and uses these together with the continuous IC50s to find optimal models (Table S5C) (Supplemental Experimental Procedures). We employed 5-fold cross-validation (CV) to select the appropriate model complexity from a set of eight possible models, ranging from single CFE predictor models to complex multi-input models with up to four CFEs. We required solutions to have specificity greater than 80%. The input features included the CGs, RACSs, gene fusions, and binarized pathway activity scores derived from the basal gene expression profiles of the cell lines (Figure S5A; Tables S5A, S5B, and S5D). The latter is based on 11 transcriptional signatures of pathway activation (Parikh et al., 2010) (Table S5B; Supplemental Experimental Procedures). LOBICO was executed for each drug separately utilizing pan-cancer and cancer-specific molecular datasets. This led to the inference of 1,112 logic models (Table S5E).


In the pan-cancer dataset we found that for 69% (182 of 265) of the drugs, the IC50s were better explained than expected by chance (p value < 0.05 and FDR < 5%). Across the cancer-specific datasets, on average, 24% of the drugs were explained by the inferred logic models (Figure 5A). We termed these logic models (182 from the pan-cancer dataset and 208 from the 18 cancer-specific datasets) “predictive models”. When considered together, the pan-cancer and cancer-specific LOBICO analyses identified predictive models for 208 out of 265 (78%) drugs. Importantly, for 85% of the 390 predictive models, a multi-input model achieved better performance than did the best single-predictor model (Figure 5B). Although the pan-cancer dataset produced the largest number of predictive models, the CV error was consistently higher than for cancer-specific datasets (Figure S5B). This is in agreement with the ANOVA analysis, where larger effect sizes were observed for the cancer-specific datasets. The response to drugs that target the p53 or ERK-MAPK pathway were especially well-predicted by LOBICO (Figure S5C).


We observed that CGs had the largest role in explaining drug response, followed by RACSs and the pathway activities derived from gene expression (Figure S5A; Supplemental Experimental Procedures). The small number of pathway signatures had a disproportionately large effect in the logic models, showing that basal pathway activation scores provide relevant information to predict drug response beyond the genomic CFEs (Costello et al., 2014) (Figure S5D).
LOBICO uncovered many known, as well as novel, associations (Table S5F). Figure 5C depicts a selection of particularly strong and consistent “and/or” combinations found for clinically approved drugs. For example, in the pan-cancer dataset, the “or” combination of KRAS or BRAF improved the precision and recall compared to single predictor models to explain cell line sensitivity to a number of MEK and RAF inhibitors (e.g., Trametinib in Figures 5C and 5D).
In general, the “or” combinations led to models with higher recall (Figure 5C, right quadrants) as compared with the single-predictor model. For example, HNSC cell lines that have an EGFR amplification or a SMAD4 mutation account for 45% (10 out of 22) of cell lines sensitive to the ERRB2/EGFR inhibitor Afatinib, whereas considering only the EGFR amplified cell lines accounts for only 32% (7 out of 22) of the sensitive cell lines (Figure 5E). Conversely, “and” combinations led to models with higher precision (Figure 5C, left quadrants). For example, BRCA cell lines that lack a deletion of the FAT1/IRF2 locus and are TP53 mutant show increased sensitivity to the ERRB2/EGFR inhibitor Lapatinib. This is achieved at higher precision (57% instead of 45% for the single predictor model), but at a lower recall (80% instead of 100%) (Figure 5F). Collectively, LOBICO analysis highlights the importance of considering combinations of oncogenic alterations as biomarkers for drug response.
Validation of Pharmacogenomic Modeling Results on Independent Datasets
We sought to validate our pharmacogenomic models using independent drug sensitivity datasets from the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) (Barretina et al., 2012) and the Cancer Therapeutics Response Portal (CTRP; second version) (Seashore-Ludlow et al., 2015). This analysis was for necessity restricted to only those compounds and cell lines shared with our own study (hereafter referred to as GDSC). The shared set consisted of 466 cell lines and 76 compounds from the CTRP study (Tables S4I–S4K) and 389 cell lines and 15 compounds from the CCLE study (Tables S4E–S4G; Supplemental Experimental Procedures). Validation was performed using IC50 values from the GDSC and CCLE studies and AUC values from the CTRP study (where IC50 values were not reported).
We performed ANOVA on the overlapping set of cell lines/compounds. We validated 53% (19 of 36 on CTRP) and 86% (6 of 7 on CCLE) of the testable sensitivity associations identified in the GDSC, and 21% (6 of 29 on CTRP) and 0% (0 of 7 on CCLE) of testable resistance associations (p < 0.05, Fisher’s exact test CTRP: p = 8.1 × 10−9; CCLE: p = 0.01; Figures S4J and S4K; Tables S4H and S4L; Supplemental Experimental Procedures). A significant Pearson correlation of the CFE-drug interaction significance was observed between the GDSC dataset and the other two datasets (R = 0.86 for CTRP and R = 0.86 for CCLE; Figures S4J and S4K). Similarly, using LOBICO, we validated 44% (17 of 39) of testable models using the CTRP, including both single and multi-input models, and observed a significant Pearson correlation of the interaction significance between the two datasets (R = 0.96; Figures S5E and S5F; Data S1C). Thus, even within the relatively limited set of overlapping drugs and cell lines, resulting in reduced statistical power, we observed reasonable-to-good rates of validation for the set of pharmacogenomic interactions identified in our study, including a number of novel associations. Complete summaries of these comparisons are provided in Tables S4E–S4L and S5G, Data S1C, and Supplemental Experimental Procedures.
Contribution of Different Molecular Data Types in Predicting Drug Response
To investigate the power of different combinations of molecular data to predict drug response, we built linear and non-linear models of drug sensitivity (elastic net [EN] regression and Random Forests [Costello et al., 2014]). As input features, we used CGs, RACSs, iCpGs, and gene expression data.
Here, we refer to EN models using IC50 values (Table S4A), but very similar results were obtained with Random Forests (Figure S6F; Table S6A). We assessed the predictive power of each model using the Pearson correlation coefficient (R) of observed versus predicted IC50 values. For each of the 265 compounds, we built pan-cancer and cancer-specific models (for 18 cancer types) and considered a model with a corresponding


and


as predictive (Figures S6G and S6H; Supplemental Experimental Procedures).


In a pan-cancer analysis, the most predictive data type was gene expression, closely followed by the tissue of origin of the cell lines (Figure 6A). By comparison, genomic features (CG mutations and RACSs alterations) performed poorly. The predictive power of gene expression and tissue type was strongly correlated, while RACSs and CGs are less correlated with the tissue type (Figure S6A). This is consistent with the tissue specificity of gene expression (Ross et al., 2000).


Next, we compared the most predictive data types in pan-cancer versus cancer-specific analyses (Figures 6B and 6C). For each drug, we identified the best-performing combination of data types and the corresponding model, referred to as the “lead model”. Notably, paired molecular data types contributed to the most lead models in both the pan-cancer (∼42% of all models) and the cancer-specific analyses (∼45% for all cancer types) (Figures 4B and 4C). In the pan-cancer analysis, all of the lead models use gene expression data (Figures 6D and 6E), but for 211 drugs (∼86%), the models are improved by including methylation, RACSs, CGs, or any combination of those additional data types. In addition, we identified 379 predictive (non-lead) models (∼17%) independent of gene expression (Figures S6B−S6E).
In a cancer-specific analysis, the majority of lead models are based solely on genomics features (Figures 6D and 6E). For 120 cases (∼38%) the lead model is based on genomics alone (CGs and RACS). We found that genomics in combination with methylation provided an additional 117 lead models (∼37%), whereas genomics in combination with gene expression contributed 19 (∼6%). The remaining lead models use methylation alone (∼7%), gene expression alone (∼3%), or a combination of genomic, epigenetic, and transcriptomic features (12%). Therefore, in the context of a cancer-specific analysis, ∼74% (237 of 319) of lead models were explained by genomics, either alone or when combined with methylation (Figures 6D and 6E).
Discussion
Constructing a Pharmacogenomics Resource
Cancer cell lines are important tools for drug development. Here, we have extended previous efforts with the systematic expansion of the pharmacological, genomic, transcriptomic, and epigenetic characterization of 1,001 human cancer cell lines. These datasets can be investigated through the COSMIC and Genomics of Drug Sensitivity in Cancer Web portal (http://www.cancerrxgene.org). To the best of our knowledge, this is the largest and most extensively characterized panel of cancer cell lines and should enable a broad range of studies linking genotypes with cellular phenotypes.
Our analysis of >11,000 patient tumor samples and the subsequent superimposing of salient cancer features on cell lines exemplifies how large-scale cancer sequencing can be used to empower biological research and maximizes the potential clinical relevance of the pharmacological models reported.
The majority of CFEs identified from a broad range of tumor types is captured within a large cell line panel and often at a frequency similar to that observed in patient cohorts. However, the picture is far from complete; many CFEs occurring at low to moderate frequency (2%–5%) are represented by a single cell line or not at all, and coverage by cancer type is variable. As we enter an era of precision cancer medicine, where many drugs are active in small molecularly defined subgroups of patients (e.g., only 3%–7% of lung cancer patients harbor the drug sensitizing EML4-ALK gene fusion [Soda et al., 2007]), the scarcity of models for many cancer genotypes and tissues is a limitation. New cell culturing technologies enable derivation of patient cell lines with high efficiency and thus make derivation of a larger set of cell lines encompassing the molecular diversity of cancer a realistic possibility (Liu et al., 2012, Sato et al., 2011).
Pharmacogenomic Models of Drug Sensitivity
Pharmacogenomic screens in cancer cell lines are an unbiased discovery approach for putative markers of drug sensitivity. We identified a wealth of molecular markers of drug sensitivity, including completely novel associations not easily explained with our current knowledge. With appropriate validation and follow-up studies, these putative biomarkers may aid patient stratification and help to explain the heterogeneity of clinical responses.
Going beyond single gene-drug interactions, “logic” combinations of CFEs consistently perform better than single events in sensitivity prediction. Clinical support for this comes from the observation that BRAF mutant melanoma patients treated with BRAF inhibitors show heterogeneity of response that may be explained by the presence of additional molecular alterations (Chapman et al., 2011). Our analyses suggest that clinical studies in cancer patients should be designed to enable combinations of genomic alterations to be detected, which has implications for both trial size and the statistical approaches employed.
We validated our pharmacogenomic models using independent datasets from the CCLE and CTRP. Consistent with previous reports, this demonstrated good consistency in the set of markers identifiable across these studies (Cancer Cell Line Encyclopedia Consortium, 2015) and lends additional support to the results presented here. However, our ability to validate some pharmacogenomic associations was restricted by the limited number of overlapping cell lines and compounds between these studies. Furthermore, the consistency between datasets is not perfect, and efforts toward standardization to reduce methodological and biological differences across the different studies are likely to improve future correlation between datasets.
Glimpses of a Precision Medicine Landscape
For many of our pharmacological models, the defining CFE is present in clinical populations at a frequency that would make testing in a clinical trial setting feasible (Figure 7). For example, the alkylating agent Temozolamide (used to treat glioblastoma multiforme) shows activity in MYCamplified colorectal cancer lines (present in 33% of primary tumors) (Figure 7A). Overall, we found that a median of 50% of primary tumor samples harbor at least one CFE, or logic combination of CFEs, associated with increased drug response; ranging from 0.63% (OV) to 83.61% (COAD/READ) (Figure 7; Tables S7A–S7C; Supplemental Experimental Procedures). This suggests that there are likely to be a number of molecular subtypes within many cancers that, following appropriate validation, could be tested in the clinical trial setting using these stratifications for treatment selection.


Using machine learning, we determined that within each specific cancer type, genomic features (either driver mutations or copy number alterations) generated the most predictive models, with the addition of methylation data further improving our models. While informative in the pan-cancer setting, baseline gene expression data was less informative in the more clinically relevant tissue-specific setting. Prioritizing the design of diagnostics that deliver driver mutations, copy number alterations, and DNA methylation profiles might be the most cost effective means in the short-term to stratify patients for cancer treatment.
Conclusions
The clinical development of molecularly targeted cancer therapies remains a formidable challenge. Our current analysis is restricted by the availability of patient genomic datasets, the cell lines and compounds screened, and methodological and biological variables, as well as the inherent limitation associated with the use of in vitro cancer cell lines. Nonetheless, our results represent a comprehensive attempt to describe the landscape of clinically relevant pharmacogenomics interactions in cellular models of cancer, complementing previous efforts (Barretina et al., 2012, Basu et al., 2013, Garnett et al., 2012, Seashore-Ludlow et al., 2015). The data resource and analyses described here should enable the matching of drug response with oncogenic alterations to provide insights into cancer biology and to accelerate the development of patient stratification strategies for clinical trial design.

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9 juillet 2016 6 09 /07 /juillet /2016 07:11

La trop célèbre « maladie de Lyme » est une maladie infectieuse transmise par l’intermédiaire d’une piqûre de tique. Quand elle passe inaperçue dans sa première phase, elle peut dans un second temps s’attaquer au système nerveux avec des conséquences dramatiques. Le Professeur Luc Montagnier l’estime très mal diagnostiquée dans notre pays, il suggère une autre approche afin de réagir plus efficacement, quand il en est temps.
La maladie de Lyme reste de nos jours, une infection très mal prise en charge dans notre pays. Transmise par une morsure de tique, la borréliose de Lyme n’est ni diagnostiquée à temps, ni soignée convenablement. Le Prix Nobel de médecine Luc Montagnier tire la sonnette d’alarme.
Il constate une « grande ignorance sur son caractère chronique« , il est venu en témoigner dimanche dernier, lors d’un colloque à Strasbourg, organisée par « Lyme sans frontières », une association regroupant des malades en colère contre l’approche officielle de la maladie. Il a insisté sur les manquements de notre système de santé :
Il est lamentable que les pouvoirs publics et les autorités de santé n’aient pas une politique cohérente sur la maladie de Lyme
Des malades très mal diagnostiqués


La maladie de Lyme ou borréliose de Lyme est une maladie infectieuse transmise par l’intermédiaire d’une piqûre de tique infectée. Difficile à diagnostiquer et mal recensée, elle peut avoir de graves conséquences si elle n’est pas traitée à temps, provoquant des troubles invalidants et douloureux. Notamment neurologiques, articulaires et musculaires, comme des méningites ou des paralysies faciales.


Selon les membres de l’association Lyme sans frontières, de nombreux patients, parfois cloués dans un fauteuil roulant, sont « baladés » de médecin en médecin et parfois traités d’hypocondriaques, faute de diagnostic adéquat.
27 000 nouveaux cas de maladie de Lyme sont officiellement déclarés chaque année en France, mais selon Lyme sans frontière, ce chiffre serait en réalité beaucoup plus important, de l’ordre de « dix fois plus ».
Symptômes et développement de la maladie de Lyme


Dans sa phase primaire, la maladie de Lyme se caractérise par une lésion cutanée, un érythème chronique migrant (ECM).
Cette lésion apparaît entre 3 à 30 jours après la piqûre d’une tique. En l’Absence de traitement, l’ ECM s’étend progressivement pendant quelques semaines, avant de disparaître sans séquelles apparentes.
Les 2ème et 3ème phases surviennent après quelques semaines et jusqu’à plusieurs années après la piqûre de tique.
Des symptômes révèlent alors la présence de la maladie :
* manifestations cutanées
* douleurs articulaires fréquentes
* manifestations cardiaques : syncopes, palpitations
* manifestations neurologiques
Des tests inefficaces qui laissent passer des personnes infectées
Pour le Pr Montagnier, 83 ans, les tests utilisés aujourd’hui pour détecter la bactérie de Lyme donnent de trop nombreux « faux négatifs », car ils sont basés sur la détection d’anticorps, alors que certains patients infectés n’en développent pas.
Le scientifique, qui travaille à Paris au sein d’un institut de recherche qui porte son nom, cherche à mettre au point une méthode de diagnostic consistant à détecter dans le plasma sanguin des traces de l’ADN de la bactérie, en captant des ondes électromagnétiques émises par l’échantillon étudié.
« A mon avis, ce test est plus fiable » que ceux actuellement en vigueur, a affirmé le Prix Nobel, tout en convenant que cette approche électromagnétique n’était « pas reconnue par un certain nombre de scientifiques, si bien qu’on a du mal à la faire valider« .
200 malades veulent attaquer les laboratoires pharmaceutiques
Une procédure civile devrait être déposée dans les prochains jours devant les tribunaux de grande instance de Paris et de Lyon, contre les laboratoires pharmaceutiques qui commercialisent les tests utilisés à ce jour. Ils sont plus de 200 malades à qui on avait annoncé qu’ils n’étaient pas porteurs de la maladie – alors qu’ils disent l’être et sont désormais soignés par antibiotiques pour cela, selon l’un des avocats en charge de cette action, Me Julien Fouray :
Dans un second temps, il y aura des responsabilités à chercher contre l’Etat, qui a validé et imposé un protocole de test dont on sait qu’il n’est pas fiable.
Basés sur un prélèvement sanguin, les tests incriminés de type « Elisa » sont produits par une demi-douzaine de laboratoires.

Fabrice Renault
8 juillet 2016

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8 juillet 2016 5 08 /07 /juillet /2016 21:30
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ORIGINAL RESEARCH ARTICLE

Front. Microbiol., 23 May 2016 | http://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2016.00743

A Drug Combination Screen Identifies Drugs Active against Amoxicillin-Induced Round Bodies of In Vitro Borrelia burgdorferi Persisters from an FDA Drug Library

Jie Feng1, Wanliang Shi1, Shuo Zhang1, David Sullivan1, Paul G. Auwaerter2 and Ying Zhang1*

  • 1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA
  • 2Fisher Center for Environmental Infectious Diseases, School of Medicine, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA

Although currently recommended antibiotics for Lyme disease such as doxycycline or amoxicillin cure the majority of the patients, about 10–20% of patients treated for Lyme disease may experience lingering symptoms including fatigue, pain, or joint and muscle aches. Under experimental stress conditions such as starvation or antibiotic exposure, Borrelia burgdorferi can develop round body forms, which are a type of persister bacteria that appear resistant in vitro to customary first-line antibiotics for Lyme disease. To identify more effective drugs with activity against the round body form of B. burgdorferi, we established a round body persister model induced by exposure to amoxicillin (50 μg/ml) and then screened the Food and Drug Administration drug library consisting of 1581 drug compounds and also 22 drug combinations using the SYBR Green I/propidium iodide viability assay. We identified 23 drug candidates that have higher activity against the round bodies of B. burgdorferi than either amoxicillin or doxycycline. Eleven individual drugs scored better than metronidazole and tinidazole which have been previously described to be active against round bodies. In this amoxicillin-induced round body model, some drug candidates such as daptomycin and clofazimine also displayed enhanced activity which was similar to a previous screen against stationary phase B. burgdorferi persisters not exposure to amoxicillin. Additional candidate drugs active against round bodies identified include artemisinin, ciprofloxacin, nifuroxime, fosfomycin, chlortetracycline, sulfacetamide, sulfamethoxypyridazine and sulfathiozole. Two triple drug combinations had the highest activity against amoxicillin-induced round bodies and stationary phase B. burgdorferipersisters: artemisinin/cefoperazone/doxycycline and sulfachlorpyridazine/daptomycin/doxycycline. These findings confirm and extend previous findings that certain drug combinations have superior activity against B. burgdorferipersisters in vitro, even when pre-treated with amoxicillin. These findings may have implications for improved treatment of Lyme disease.

Introduction

Lyme disease may affect multiple organs in disseminated infection and is the most common vector-borne infection reported in the United States and Europe. In the United States, the number of reported Lyme disease cases has increased over last 15 years and a recent calculation estimated that about 300,000 cases occur annually (CDC, 2015a). About 10–20% of patients treated for Lyme disease with a recommended 2–4 week antibiotic therapy have lingering symptoms of fatigue, pain, or joint and muscle aches (CDC, 2015a). In some cases, when such symptoms extend beyond 6 months after initial antibiotic treatment, post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS) has been proposed (CDC, 2015b) that in placebo-controlled, randomized trials that does not appear to respond to additional treatment with current Lyme antibiotics (Wormser et al., 2006; Klempner et al., 2013; Berende et al., 2016), though improved symptoms were noted in other trials (Krupp et al., 2003; Fallon et al., 2008).

The spirochete Borrelia burgdorferi sensu lato is the causative agent of Lyme disease (Meek et al., 1996). B. burgdorferi is transmitted by tick vectors that also feed upon host reservoirs including rodents, reptiles, birds and deer (Radolf et al., 2012). In bacterial culture systems, the morphology of B. burgdorferi is mainly in spirochetal form during log phase growth, but transforms to morphological variant forms such as round bodies and microcolonies in older, stationary phase cultures (Feng et al., 2014a, 2015) or when the bacteria are subjected to adverse or stress conditions (Brorson and Brorson, 1997; Murgia and Cinco, 2004). For example, oxidative stress, pH variation, heat and antibiotic exposure can induce B. burgdorferi to form round bodies (sometimes referred to as cystic forms which are coccoid and membrane-bound cells) (Kersten et al., 1995; Murgia and Cinco, 2004; Brorson et al., 2009).

In vitro studies have shown that the round body form of B. burgdorferi is not only viable but also could revert to spirochetal form under suitable conditions (Brorson and Brorson, 1997; Murgia and Cinco, 2004). These round bodies appear to have both lower metabolism and greater resistance to antibiotic treatment, which appears common to stationary phase bacteria in culture generally. Some have suggested that these round body forms might be a protective mechanism to overcome adverse environmental conditions (Murgia and Cinco, 2004; Brorson et al., 2009). Although the round body forms of B. burgdorferi have been described in human infections including brain tissue (Miklossy et al., 2008), this finding has not been widely observed in the scientific literature, and their significance in Lyme disease is unclear (Lantos et al., 2014).

Amoxicillin and doxycycline are among the most commonly used frontline drugs for the treatment of Lyme disease, but have poor activity against in vitro, stationary phase cultures enriched with persister forms including round bodies and microcolonies (Kersten et al., 1995; Brorson et al., 2009; Barthold et al., 2010; Sapi et al., 2011; Feng et al., 2015). Commonly used Lyme antibiotics doxycycline and penicillin have been shown experimentally to induce B. burgdorferi from spirochetal to round bodies or cystic round structures forms in culture (Kersten et al., 1995). In this study, we took advantage of this observation and established a round body persister model using amoxicillin-treated organisms to screen a FDA-approved drug library with a newly developed SYBR Green I/propidium iodide (PI) assay (Feng et al., 2014a,b). We sought to investigate whether some non-traditional drugs or drug combinations had improved activity against the amoxicillin-induced round body form as distinct from the previous drug candidates identified from non-antibiotic treated stationary phase culture (Feng et al., 2014a).

Materials and Methods

Strain, Media and Culture

Borrelia burgdorferi strain B31 was obtained from American Type Tissue Collection. B. burgdorferi and was cultured in BSK-H media (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.), with 6% rabbit serum (Sigma–Aldrich, Co). All culture media were filter-sterilized by 0.2 μm filter. Cultures were incubated in sterile 50 mL closed conical tubes (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) at 33°C without antibiotics.

Induction of Round Body Form of B. burgdorferi

For induction of B. burgdorferi to round body forms, B. burgdorferi spirochetes (1 × 105spirochetes/ml) were cultured in BKS-H medium for 5 days without shaking when the bacteria are still in log phase (Feng et al., 2014a). After 5 days of incubation, amoxicillin at a final concentration of 50 μg/ml was added to the culture for round body form induction. After 72 h at 33°C, B. burgdorferi were examined by microscopy following SYBR Green I/PI staining to confirm round body formation. The round body cells (100 μl) were transferred to 96-well tissue culture microplates for evaluation of the effects of treatment with antibiotics or FDA drug library (see below). To confirm the viability of induced round body form, we subcultured the induced round bodies in fresh BSK-H medium. The round bodies (in 500 μl culture) were collected by centrifugation and rinsed with 1 ml fresh BSK-H medium followed by resuspension in 500 μl fresh BSK-H medium. Then 50 μl of cell suspension was transferred to 1 ml fresh BSK-H medium for subculture at 33°C for 5 days.

Microscopy Techniques

Specimens were examined on a Nikon Eclipse E800 microscope equipped with differential interference contrast (DIC) and epi-fluorescence illumination, and recorded with a Spot slider color camera. Cell proliferation assays were performed by direct counting using a bacterial counting chamber (Hausser Scientific Partnership, Horsham, PA, USA) and DIC microscopy. To assay the viability of B. burgdorferi, the SYBR Green I/PI assay (Feng et al., 2014a) was performed. The ratio of live (green) and dead (red) B. burgdorferi was calculated by counting the cells using a bacterial counting chamber and epi-fluorescence microscopy.

Antibiotics and FDA Drug Library

Doxycycline, metronidazole, cefmetazole, rolitetracycline, sulfachlorpyridazine, artemisinin, cefoperazone, daptomycin (Sigma–Aldrich) were dissolved in suitable solvents (Wikler and Ferraro, 2008) to form stock solutions. The antibiotic stocks were filter-sterilized by 0.2 μm filter, except metronidazole and artemisinin which were dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) and not filtered. Then the stocks were diluted into 500 μM pre-diluted stocks and stored at -20°C.

Each drug in the JHCCL FDA-approved drug library version 1.32 (Chong et al., 2006) was predispensed in 10 mM stock solutions with DMSO. The stock solutions were arrayed in a total of 27 96-well plates, leaving the first and the last columns in each plate as controls. Each solution in these master plates was diluted with PBS to make 500 μM pre-diluted working stock plates. The first and the last columns in each pre-diluted plate were set as blank controls, doxycycline control, metronidazole control and amoxicillin control. The pre-diluted drug stock plates were sealed and stored at -20°C.

Drug Screen and Antibiotic Susceptibility Testing

To qualitatively determine the effect of antibiotics in a high-throughput manner, 10 μl of each compound (final concentration 50 μM) from the pre-diluted plate or pre-diluted stock was added to 3 days amoxicillin induced round body form from a 5 day-old stationary phase B. burgdorferi culture in the 96-well plate. The final volume per well was adjusted to 100 μl. Plates were sealed and placed in 33°C incubator for 7 days. SYBR Green I/PI viability assay was used to assess the live and dead cells after antibiotic exposure as described (Feng et al., 2014a). Briefly, 10 μl of SYBR Green I (10,000 × stock, Invitrogen) was mixed with 30 μl propidium iodide (PI, 20 mM, Sigma) into 1.0 ml of sterile dH2O. Then 10 μl staining mixture was added to each well and mixed thoroughly. The plates were incubated at room temperature in the dark for 15 min followed by plate reading at excitation wavelength at 485 nm and the fluorescence intensity at 535 nm (green emission) and 635 nm (red emission) in microplate reader (HTS 7000 plus Bio Assay Reader, PerkinElmer Inc., USA). With least-square fitting analysis, the regression equation and regression curve of the relationship between percentage of live and dead bacteria as shown in green/red fluorescence ratios was obtained. The regression equation was used to calculate the percentage of live cells in each well of the 96-well plate.

The standard microdilution method (Chong et al., 2006) was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) that would inhibit visible growth of B. burgdorferi after 72 h incubation. B. burgdorferi cells (1 × 105) were inoculated into each well of a 96-well microplate containing 90 μL fresh BSK-H medium per well. Each diluted compound (10 μL) was added to the culture. All experiments were run in triplicate. The 96-well plate was sealed and placed in an incubator at 33°C for 5 days. Cell proliferation was assessed using the SYBR Green I/PI assay and a bacterial counting chamber after the incubation.

Subculture of Antibiotic-Treated B. burgdorferi to Assess Viability of the Organisms

Amoxicillin-induced round body form and 10-day old stationary phase culture (500 μl) of B. burgdorferi was treated with 10 μg/ml drugs or their combinations for 7 days in 1.5 ml Eppendorf tubes as described previously (Feng et al., 2015). After incubation at 33°C for 7 days without shaking, the cells were collected by centrifugation and rinsed with 1 ml fresh BSK-H medium followed by resuspension in 500 μl fresh BSK-H medium without antibiotics. Then 50 μl of cell suspension was transferred to 1 ml fresh BSK-H medium for subculture at 33°C for 10–20 days. Cell proliferation was assessed using SYBR Green I/PI assay and bacterial counting chamber (Hausser Scientific Partnership, Horsham, PA, USA) by microscopy as described above.

Results

Induction of Round Body Form of B. burgdorferi by Amoxicillin

Beta-lactam antibiotics are among the most commonly used drugs for the treatment of Lyme disease, but intriguingly in vitro induce spirochetal B. burgdorferi to form round bodies that are subsequently resistant to many antibiotics (Brorson et al., 2009; Sapi et al., 2011). In order to identify FDA-library drugs active against the round body form of B. burgdorferi, we first assessed conditions that yielded the highest induction of round body forms. The 6-day or older culture could not be induced to round body form completely (<80%) with even 100 μg/ml amoxicillin (Figure 1D), whereas a 5-day B. burgdorferi culture treated with 50 μg/ml amoxicillin for 72 h was the best condition for producing round bodies. Microscopic examination showed that in 5-day old culture after 3-day amoxicillin induction, up to 96% of the B. burgdorferi spirochetes could be induced into round bodies by amoxicillin (Figure 1A). To confirm that the induced round body form was still viable, we performed a subculture test in fresh BSK-H medium. Microscopy analysis revealed that amoxicillin-induced round bodies of B. burgdorferi could revert to spirochetes (95 ∼ 99%, n = 5) in BSK-H medium after 5 days subculture (Figure 1), indicating that the round bodies induced by amoxicillin treatment remained viable upon subculture.

FIGURE 1

FIGURE 1.Microscopy demonstrating round body formation in the presence of amoxicillin and subsequent reversion to spirochetal form of B. burgdorferi during subculture. (A)A 5-day old B. burgdorferi culture without amoxicillin consisting primarily of spirochetal form. (B) Coccoid round body forms formed from B. burgdorferi spirochetes upon treatment with amoxicillin (50 μg/ml) for 3 days. (C)Reversion of round body form of B. burgdorferifrom (B) to spirochetal form after 5 days subculture in fresh BSK-medium. (D) 7-day old stationary phase B. burgdorferi treated with 100 μg/ml amoxicillin for 3 days. The images were derived from the above samples stained by SYBR Green PI viability assay followed by microscopy (400 × magnification) as described in Section “Materials and Methods.”

To compare the antibiotic susceptibility of the round body form of B. burgdorferi with the spirochetal form, we tested commonly used antibiotics for Lyme disease including doxycycline, cefuroxime, and ceftriaxone on 5-day old spirochetes and amoxicillin-induced round body form of B. burgdorferi. The results showed that the round body form of B. burgdorferi was more tolerant or resistant to antibiotics than the spirochetal form (Figure 2). The amoxicillin induced-round body form was subsequently used for drug screens as described below.

FIGURE 2

FIGURE 2.Exposure of spirochetal form and amoxicillin-induced round bodies of B. burgdorferi (5-day old) to different antibiotics. Log phase spirochetal form (5 day old) and amoxicillin-induced round bodies of B. burgdorferi (5-day old) were exposed to 50 μM doxycycline, cefuroxime, and ceftriaxone, respectively, for 5 days. The percentage of residual live cells (n = 3) was determined by SYBR Green I/PI assay followed by fluorescence microscopy counting.

Screen for Drugs Active against Round Bodies of B. burgdorferi

Round body forms of B. burgdorferi are resistant to many antibiotics (Brorson et al., 2009; Sapi et al., 2011), so we used 50 μM concentration to increase the sensitivity of the FDA drug library screen. The amoxicillin-induced round bodies of B. burgdorferi were incubated in the 96 well plates with the library drug compounds (50 μM) for 7 days. As prior studies suggested that metronidazole and tinidazole were active against the round body form of B. burgdorferi (Brorson and Brorson, 1999; Sapi et al., 2011), they were included in each plate as positive controls for comparison in the drug screen. Of the 1581 FDA-library drugs tested, 23 antibiotics were found to have higher activity against the round bodies of B. burgdorferi than amoxicillin (46% residual viable cells) and doxycycline (42% residual viable cells) (Table 1). These effective hits were confirmed in further rescreens followed by fluorescence microscope counting after SYBR Green I/PI stain to verify the screening results. Among the 23 effective hits, 11 drugs (daptomycin, artemisinin, ciprofloxacin, sulfacetamide, sulfamethoxypyridazine, nifuroxime, fosfomycin, chlortetracycline, sulfathiazole, clofazimine and cefmenoxime, in order of decreasing activity) had better activity than compounds previously described with round body activity: metronidazole and tinidazole (each with 33% residual viable cells) (Table 1; Figure 3). The antimalarial drug artemisinin showed higher activity (24% residual viable cells) against the round bodies of B. burgdorferi. Interestingly, ciprofloxacin (28% residual viable cells) was the most active among quinolone drugs tested compared to levofloxacin 41%, norfloxacin 41%, and moxifloxacin 49%. In addition, chlortetracycline, meclocycline and rolitetracycline were more active than doxycycline (42% residual live cells) against the round bodies (Table 1). On the other hand, some cell wall inhibitors such as vancomycin and macrolide antibiotic carbomycin, which had reasonable activity against stationary phase B. burgdorferi in our previous study (Feng et al., 2014a) showed relatively weak activity against the amoxicillin-induced round bodies of B. burgdorferi with 38 and 43% residual live cells, respectively.

TABLE 1

TABLE 1.Twenty-three drugs with better activity than amoxicillin against round bodies of B. burgdorferi∗.

FIGURE 3

FIGURE 3.Representative images (400 × magnification) of amoxicillin-induced round body form of B. burgdorferi treated with different antibiotics (labeled on the image). A 6- day old culture was induced with 50 μg/ml amoxicillin for 72 h and subsequently treated with the listed antibiotics (50 μM) for 7 days followed by staining with SYBR Green I/PI assay and fluorescence microscopy.

MIC Values of Round Body Active Antibiotics

In our previous study, we found that the activity of antibiotics against non-growing persisters was not always correlated with their activity against growing B. burgdorferi (Feng et al., 2014a). We therefore used log phase cultures to test the MICs of selected active hits artemisinin and ciprofloxacin that had excellent activity against the round bodies of B. burgdorferiusing the SYBR Green I/PI assay and microscope counting. The MIC value of artemisinin was quite high at 50∼100 μg/ml for growing B. burgdorferi, indicating that artemisinin is much less active against growing organisms, despite its high activity against the non-growing round bodies of B. burgdorferipersisters. In contrast, ciprofloxacin was quite active against the growing B. burgdorferi with a low MIC (0.8∼1.6 μg/ml), which is in agreement with a previous study (Kraiczy et al., 2001), indicating that it is active against both growing form and non-growing round body form of B. burgdorferi.

Effect of Drug Combinations on the Round Body Form and the Stationary Phase B. burgdorferi Persisters

We previously found that stationary phase cultures are enriched with morphological variants such as round bodies and biofilm-like aggregated microcolonies (Feng et al., 2014a, 2015). These morphological variants of B. burgdorferi have different antibiotic susceptibilities (Brorson et al., 2009; Sapi et al., 2011; Feng et al., 2015), and our recent study showed that some drug combinations are more effective against aggregated B. burgdorferipersisters than single drugs (Feng et al., 2015). To identify the best drug combinations with the active hits from the above screens against the round bodies of B. burgdorferi, we evaluated drugs with improved activity detected in this screening including artemisinin, cefmetazole, and sulfachlorpyridazine in combination with drugs identified in the earlier study that appeared to work well against persisters when used in combination (Feng et al., 2015). In the drug combination study, we used 10 μg/ml, a lower concentration near the achievable Cmax values of most drugs. With this approach, drug combinations were much more effective than individual drugs used alone against the round bodies (Table 2; Figure 4). Overall, the round body forms were more susceptible to the tested drugs or drug combinations than the 10 day old stationary phase culture which was enriched with more resistant aggregated microcolonies (Feng et al., 2014a, 2015) (Table 2). It is worth noting that antimalarial drug artemisinin highlighted itself as having among the best activity against the stationary phase B. burgdorferi persisters when combined with other drugs. For example, artemisinin in combination with doxycycline and cefoperazone showed excellent activity against the stationary phase B. burgdorferi persisters (24% residual viable cells, Table 2, Figure 4, o). Cefmenoxime and cefmetazole were the most effective of the cephalosporin drugs tested against the round body form of B. burgdorferi. In addition, we noted that the sulfa drug sulfachlorpyridazine when combined with daptomycin and doxycycline showed good activity against B. burgdorferi persisters (21% residual viable cells, Figure 4, n). Moreover, sulfachlorpyridazole combined with doxycycline and daptomycin showed the best activity against the round body form of B. burgdorferi persisters (8% residual cells, Table 2).

TABLE 2

TABLE 2. Effect of drug combinations on the round body form and stationary phase culture of B. burgdorferi persisters∗

FIGURE 4

FIGURE 4. Effect of antibiotics alone or in combinations on stationary phase B. burgdorferi strain B31 (A) and strain 297 (B)microcolonies.Stationary phase culture of B. burgdorferi (10-day old) was treated with 10 μg/ml drugs alone or in combinations (labeled on the image) for 7 days followed by staining with SYBR Green I/PI assay and epifluorescence microscopy (200 × magnification). Green cells indicate live cells whereas red cells dead cells. Abbreviation: Dox, doxycycline; CefP, cefoperazone; Art, Artemisinin; Dap, daptomycin; CefM, cefmetazole; Scp, sulfachlorpyridazine.

We also tested some drugs and drug combinations on a different clinical isolate B. burgdorferi strain 297 to confirm if they also work on different strains other than strain B31. Indeed, we found no significant difference in the activity of these drugs and drug combinations for the two different strains (Figure 4B).

Subculture Studies to Evaluate the Activity of Drug Combinations against Round Bodies

To confirm the durability of the drug combinations in killing round bodies, we performed subculture studies in BSK-H medium as described in our previous study (Feng et al., 2015). We found that drug-free round body controls and samples treated with any single drugs grew back routinely in 10-day subcultures (Table 3). Samples treated with two drug combinations grew more slowly (Table 3). However, the three drug combinations, e.g., doxycycline/daptomycin plus either cefoperozone or artemisinin or sulfachlorpyridazine did not show any sign of growth as no visible spirochetes were observed after 10-day subculture, whereas other drug combinations all had visible live spirochetes growing as observed by SYBR Green I/PI microscopy (Table 3). After 20-day subculture, there were about 8 × 106 spirochetes in the control sample and about 5 × 106 spirochetes in doxycycline-treated samples (Table 3). Daptomycin alone, or two drug combinations doxycycline/cefoperazone and doxycycline/daptomycin could not sterilize the round bodies of burgdorferi, as they all had visible spirochetes growing after 20 day subculture (Figure 5). However, doxycycline/daptomycin and either artemisinin or sulfachlorpyridazine significantly reduced the number of spirochetes with very few spirochetes being visible after 20 day subculture (Figure 5). As in our previous study (Feng et al., 2015), daptomycin in combination with doxycycline and cefoperazone also showed the best activity which killed all round body form of B. burgdorferi persisters with no viable spirochetes observed after 20 day subculture (Figure 5). In a separate experiment, we found BSK-H medium stored under experimental conditions for 20 days showed no loss or inactivation of nutrients, since B. burgdorferidisplayed the same normal exponential growth in either 20 day old medium or fresh medium.

TABLE 3

TABLE 3.Subculture following exposure to single drugs or drug combinations to assess the viability of remaining round body forms of B. burgdorferi.

FIGURE 5

FIGURE 5.Subculture of amoxicillin-induced round bodies of B. burgdorferiafter treatment with different antibiotics alone or in combinations (labeled on the image). Six day old of B. burgdorferi culture was induced with 50 μg/ml amoxicillin for 72 h to form round bodies, which were then treated with single antibiotics alone or in combination. Representative images (200 × magnification) were taken with fluorescence microscopy using SYBR Green I/PI staining. Only Dox + Dap + CefP completely killed all round body B. burgdorferi persisters as shown by lack of any viable green spirochetes after 20-day subculture. Abbreviation: Dox, doxycycline; CefP, cefoperazone; Dap, daptomycin; Art: artemisinin; Scp, sulfachlorpyridazine.

Discussion

Previous in vitro studies showed that the round body form of B. burgdorferi as a persister form could survive in adverse conditions including antibiotic exposure in culture (Kersten et al., 1995; Brorson et al., 2009; Barthold et al., 2010). Although metronidazole, tinidazole and tigecycline were reported individually to have activity against these round body forms, they were unable to completely eradicate these persisters in culture (Sapi et al., 2011). In this study, to identify more effective drugs active against round bodies, we first established an amoxicillin-induced round body model of B. burgdorferi persisters and then screened an FDA-approved drug library for highest activities against the round bodies. We were able to identify 23 drug candidates that are more active than doxycycline or amoxicillin, 11 of which had better activity against the round body form of B. burgdorferi (Table 1) than metronidazole or tinidazole, which were previously cited as having such abilities to kill round body forms (Brorson and Brorson, 1999; Sapi et al., 2011).

We used a relatively high concentration (50 μM) of drug candidates in the drug screen. A major reason to do so is that lower concentration of drugs (10 μM commonly used in different drug screens) in our previous studies identified very few drug candidates because stationary phase cultures or round body forms induced by amoxicillin are quite resistant to drugs or antibiotics. This necessitates the use of higher drug concentrations to identify any drug candidates with activity against these resistant forms. Some of the identified drug candidates though show weak activity on their own, can be quite active in the drug combinations (Feng et al., 2015, 2016). Thus, an initial relatively high drug concentration would be helpful to identify these drugs in the high throughput screen, and this is followed by use of a lower concentration (10 μg/ml) for each candidate drug in drug combination tests which show good activity. It is worth noting that most drugs’ Cmax values are higher than or close to this 10 μg/ml concentration used in this study.

In a previous study, we identified several drugs that show excellent activity against stationary phase B. burgdorferi from an FDA drug library (Feng et al., 2014a). Replication of activity against B. burgdorferi round body persisters by daptomycin, clofazimine and sulfa drugs in this study validates our previous findings that such drugs are active against persisters in the stationary phase model (Feng et al., 2014a). Importantly, we also identified additional drugs active against the amoxicillin-induced round bodies of B. burgdorferi that did not show good activity in the previous drug screen against the stationary phase B. burgdorferi (Feng et al., 2014a). These include artemisinin, ciprofloxacin, nifuroxime, fosfomycin, tinidazole, loracarbef, and thymol that appear to have enhanced activity against the round body form. The reason why these new drug candidates are identified that are distinct from the previous screen on stationary phase culture without antibiotic treatment is presumably a reflection of the difference in the amoxicillin-induced round bodies being used in this screening process. Nevertheless, it is interesting that despite the difference of the two models, some common drug candidates such as daptomycin, clofazimine and sulfa drugs were found to be active in both persister models. These findings suggest the two persister models, i.e., stationary phase culture and amoxicillin-treated, may have overlapping persister cell subpopulation characteristics among the very heterogeneous persister population (Feng et al., 2014a; Zhang, 2014). Both may be useful methods for persister drug screenings.

As in our previous study (Feng et al., 2014a), daptomycin remains the most active drug against the round bodies of B. burgdorferi.Daptomycin killed most planktonic round body form of B. burgdorferi (Figure 3b). It is possible that daptomycin preferentially acts on the membrane of the round body form of B. burgdorferi that is different from the membrane of actively growing spirochetal form. Daptomycin is known to disrupt the Staphylococcus aureus membrane structure and cause rapid depolarization thus depleting membrane energy that may be required for viability of the persisters (Pogliano et al., 2012). The drug has been shown to work more effectively in combination with beta-lactams, for example, against antibiotic resistant enterococci (Brown et al., 2015).

An interesting finding of the study is the observation that the antimalarial drug artemisinin also showed excellent activity against the round body form of B. burgdorferipersisters (Figure 3e). It is worth noting that artemisinin similar to daptomycin has a high MIC (50–100 μg/ml) against growing B. burgdorferi, while showing excellent activity against the round bodies of B. burgdorferi.Artemisinin is a commonly used antimalarial drug isolated from the wormwood plant Artemisia annua, a Chinese herbal medicine. The mechanism of artemisinin action is not well understood. The antimalarial activity of artemisinin might involve endoperoxide activation by free ferrous iron from hemoglobin digestion by malaria parasites (Wells et al., 2009). However, the content of ferrous iron or hemoglobin is very low in the B. burgdorfericulture (Rodriguez et al., 2007), so the activation of endoperoxide might not be the main mechanism of artemisinin activity against B. burgdorferi round bodies. In yeast, artemisinin impairs the membrane structure and causes depolarization of the mitochondrial membrane (Li et al., 2005; Wang et al., 2010). In this respect, it is possible that artemisinin may have a similar mechanism of action as daptomycin in disrupting the bacterial membrane as the basis for its high activity against the round bodies of B. burgdorferi.

We previously found daptomycin combined with doxycycline and cefoperazone could best eliminate the most resistant biofilm-like microcolonies of B. burgdorferi (Feng et al., 2015, 2016). In this study, we found artemisinin was the best alternative drug in combination with doxycycline and cefoperazone compared to daptomycin-containing regimen and showed excellent activity against the amoxicillin-induced round body form of persisters (Table 2; Figure 3c). We also noticed the lipophilic antibiotic clofazimine, which has complex antimicrobial activity including membrane disruption and depolarization (Van Rensburg et al., 1992; Cholo et al., 2012), also showed good activity against both round body form and stationary phase persisters (Feng et al., 2014a). The results using artemisinin, clofazimine and daptomycin (Feng et al., 2014a) suggest membrane disruption may be a good approach to killing B. burgdorferi persisters.

Besides the top-ranked hits of screened drugs, we found many sulfonamide antibiotics such as sulfacetamide, sulfamethoxypyridazine and sulfaquinoxaline are highly active against the round body form (Table 1). The sulfonamide antibiotics have also been identified in the previous drug screen against stationary phase persisters and showed low MICs (<0.2 μg/ml) (Feng et al., 2014a). The sulfonamides inhibit utilization of PABA required for the synthesis of folic acid, which results in blockade of several enzymes needed for synthesis of DNA and methionine, glycine, and formylmethionyl-transfer-RNA. Because methionine is a methyl group donor, sulfa drugs may also inhibit methylation process in B. burgdorferi, which may be important for their anti-persister activity. It is worth noting that sulfachloropyridazine as an analog of sulfamethoxypyridazine also showed good activity against stationary phase B. burgdorferi(residual viable cells about 38%). When combined with daptomycin/doxycycline this trio showed remarkable activity against stationary phase B. burgdorferi (residual viable cells is about 8%) (Table 2). We believe that further studies on metabolic changes of the round body form of B. burgdorferi could help understand the mechanisms by which sulfa drugs act against B. burgdorferi persisters.

In addition to the previously described daptomycin, clofazimine, cefoperazone and, sulfa drugs (Feng et al., 2014a), we also discovered some additional drugs preferentially active against the amoxicillin-induced round bodies of B. burgdorferi. The fluoroquinolone drug ciprofloxacin has previously been shown to be active against B. burgdorferi in vitro and could kill the inoculum at a relatively high concentration of 16 μg/ml minimum bactericidal concentration (MBC) (41.5 μM) after 72 h incubation (Kraiczy et al., 2001). Here we found that ciprofloxacin was the most active of the fluoroquinolones against the round bodies of B. burgdorferi, but it was not identified to have activity against B. burgdorferi stationary phase persisters in our previous screen (Feng et al., 2014a) as it was not in the prior version of the FDA drug library (version 1.1). However, ciprofloxacin (50 μM) alone could not completely kill the round bodies after 7 days. This indicates that the round body form is more resistant or tolerant to this antibiotic than multiplying B. burgdorferi.On the other hand, we also noticed some drugs such as nifuroxime and thymol did not show activity in the previous drug screens on stationary phase B. burgdorferi (Feng et al., 2014a, 2015), but showed good activity against the round body form in this study. This specific activity against the round body form could be related to the physiological difference of different morphological forms and/or the synergistic activity of these drugs with amoxicillin used to induce round forms used for drug screens. It is of interest that chlortetracycline was more active than doxycycline against the round body forms and that nitrofuran derivative nifuroxime was more active than metronidazole or tinidazole (Table 1). These findings could indicate the side chain involved in both cases may have conferred additional activity against the round body persisters.

We did the drug combination test on the stationary phase B. burgdorferi using the nifuroxime analog nitrofurantoin (residual live cell, 39%), and the results showed that nitrofurantoin combined with cefoperazone was more effective than each drug alone (Table 2). Likewise, the natural antimicrobial thymol combined with amoxicillin showed good activity (residual percentage, 34%) in the round body drug screen but thymol alone did not work on the stationary phase B. burgdorferi (residual live cell percentage, 82%) in the previous drug screen. Palaniappan and Holley (2010)reported that thymol could reduce the resistance in E. coli and S. aureus to ampicillin and penicillin. This synergistic activity between thymol and beta-lactams may explain its activity against the B. burgdorferi round body form. These results suggest that the drug combination could be an effective approach if B. burgdorferi persisters are playing a significant role.

However, some drugs that had activity against stationary phase B. burgdorferi such as beta-lactams, vancomycin, streptomycin, and amphotericin B (Feng et al., 2014a) did not show good activity against the round body form (Table 1). However, we noted two cephalosporins, cefmenoxime and cefmetazole showed good activity against the round body form of B. burgdorferi. In the previous drug screen on stationary phase B. burgdorferi, cefoperazone, which was the best cephalosporin for killing stationary phase B. burgdorferi, also had certain activity against the round body form (not shown). Future studies are needed to explore the mechanism of action of these cephalosporins that have activity against the round body B. burgdorferi persisters which may involve targets beyond the cell wall synthesis. Vancomycin is a glycopeptide antibiotic acting on the cell wall rather than acting on the cell membrane like daptomycin. We did not find good activity of vancomycin against amoxicillin treated round bodies, though it showed relatively good activity against stationary phase B. burgdorferi in the previous drug screen (Feng et al., 2014a). This might be due to the relative cell wall deficiency state of the round body form induced by amoxicillin.

Despite the description of drug candidate’s active against the round body forms, their significance in improving the treatment remains to be determined. While evidence that round body form of persisters examined in this study may occur in vivo during infection remains to be confirmed, it is also unknown if antibiotics that target such potential persisters would lead to improved outcomes in human infection compared with standard Lyme disease treatment with doxycycline or amoxicillin that do not have good activity against the round body forms of B. burgdorferi (Brorson et al., 2009; Barthold et al., 2010) or if they even induce such forms in vivo. These studies indicate that it would be difficult to kill the round body form of B. burgdorferi using the current Lyme antibiotics if similar organisms exist in vivo or are incompletely eradicated in the human host under environmental stressors. The drug candidates identified in this study could allow the above possibility to be tested in animal models of persistence using the drug combinations that are active against round body forms of B. burgdorferi in the future.

In summary, this study represents the first high throughput drug combination screen using an FDA library against amoxicillin-induced round body forms of B. burgdorferi. Several FDA-approved drugs show excellent activity against such forms. Drug candidates that are preferentially active against the round bodies include artemisinin, ciprofloxacin, nifuroxime, fosfomycin, chlortetracycline, and some sulfa drugs. We found that triple drug combinations artemisinin/cefoperazone/doxycycline, daptomycin/sulfachlorpyridazine//doxycycline and daptomycin/cefoperazone/ doxycycline had among the best activity against both the round body model and the stationary phase persister model. These round body effective drugs and drug combinations provide new candidates for further evaluation in animal studies and potentially clinical investigation to determine whether drug combinations could improve resolution of symptoms in those patients who do not appropriately or completely respond to traditional antibiotic therapy for Lyme disease.

Conclusion

In this study, we performed a drug combination screen using an FDA drug library on amoxicillin-induced round bodies of B. burgdorferi that identified 23 drug candidates with higher activity than either amoxicillin or doxycycline. Eleven of the 23 candidates had higher anti-round body activity than either metronidazole or tinidazole. Although some drug candidates such as daptomycin and clofazimine overlapped with a previous screen against stationary phase B. burgdorferi, new active drug candidates identified include artemisinin, ciprofloxacin, nifuroxime, fosfomycin, chlortetracycline, sulfacetamide, sulfamethoxypyridazine and sulfathiozole that have high activity against round body forms. We found two triple drug combinations artemisinin/cefoperazone/doxycycline and sulfachlorpyridazine/daptomycin/doxycycline, which had the highest activity against round bodies and stationary phase B. burgdorferipersisters. Further in vivo animal and human studies are needed to evaluate the significance of these findings for improved treatment of Lyme disease.

Author Contributions

YZ conceived the experiments; JF, WS, SZ, and DS, performed the experiments; JF, DS, and YZ analyzed the data; and JF, PA, and YZ wrote the paper.

Conflict of Interest Statement

The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

Acknowledgments

We acknowledge the support of our work by Global Lyme Alliance, Johns Hopkins Fisher Center for Environmental Infectious Diseases, and Steven & Alexandra Cohen Foundation. We also thank Lyme Disease Association, NatCapLyme, Steve Sim, and Jonathan Locke for their support. YZ was supported in part by NIH grants AI099512 and AI108535.

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8 juillet 2016 5 08 /07 /juillet /2016 16:25

Fiabilité des tests, forme chronique, co-infectionsZizanie autour de la maladie de Lyme

07.07.2016

Plus que jamais aujourd'hui, en Europe et aux États-Unis, la maladie de Lyme divise. Presque toutes les thématiques - épidémiologie, fiabilité des tests, modes de transmission - sont, ou ont été, sujettes à controverses. Mais plus que tout, c'est la question des formes tardives, - Lyme chronique ou manifestations post-Lyme -, et de leur traitement par une antibiothérapie au long cours, qui est au cœur des débats.

« Une grande simulatrice », comme la syphilis, une autre infection à spirochète, la maladie de Lyme a reçu ce qualificatif dès sa découverte en 1982 par l'entomologiste William Burgdorfer. Loin de se dissiper, le mystère autour de cette borréliose transmise par les tiques (Ixodes ricinus) a pris de l'ampleur en trente ans.

Le consensus de 2006 de la SPILF est remis en question, comme le sont outre-Atlantique les recommandations de l'IDSA (International Diseases Society of America). Mais plus que tout, c'est la question des formes tardives, - Lyme chronique ou manifestations post-Lyme -, et de leur traitement par une antibiothérapie au long cours, qui est au coeur des débats. Dans ce contexte très polémique, les autorités de santé sont prises à partie comme arbitre.

Près de 27 000 cas déclarés chaque année

Le Pr Christian Perronne, fer de lance médiatisé de la reconnaissance de la borréliose mais contesté pour son approche thérapeutique atypique, n'a aucun doute : « La maladie de Lyme est largement sous-diagnostiquée, c'est un véritable scandale de santé publique », en référence aux nombreux patients laissés à leur désarroi faute de diagnostic fiable.

Que disent les chiffres ? Près de 27 000 cas de la borréliose sont déclarés chaque année en France par le réseau Sentinelles de l'InVS. « Pour des raisons d'écologie avec la prolifération d'animaux porteurs de tiques, la fréquence est en augmentation de façon incontestable en France comme dans les autres pays riches, estime le Pr François Bricaire, infectiologue à l'hôpital de la Pitié-Salpêtrière (Paris). Le Pr Patrick Berche, microbiologiste et directeur de l'Institut Pasteur de Lille, partage cet avis : « La situation est certainement sous-estimée en France. Il existe une grande disparité entre les régions, avec plus de 100 cas pour 100 000 habitants en Alsace, en Champagne-Ardennes, et en Auvergne. Cela suggère que les tests ne sont pas à jeter mais à améliorer ».

Sérologie et formes chroniques

La sensibilité et la spécificité des tests sérologiques sont au centre de toutes les polémiques particulièrement dans le contexte de la maladie de Lyme chronique. Si la réalité des formes tradives reste controversée, leur reconnaissance gagne du terrain. Aux États-Unis, à la suite du procès intenté par les patients, le site officiel des National Clearing House a abandonné les recommandations de l'IDSA pour celles de l'ILADS (International Lyme and Associated Diseases Society), qui reconnaît la persistance de l'infection. « Il a été démontré que la bactérie peut persister dans les tissus, développe le Pr Perronne. Il existe des formes dormantes, la bactérie peut même changer de forme ». Même le Pr Jaulhac de Strasbourg n'exclut pas la possibilité de Lyme chronique en précisant que « les formes tardives sont exceptionnellement séronégatives*. Si un premier traitement ne marche pas, il faut surtout rechercher autre chose ».

Pour le Pr Bricaire, toute la difficulté avec les formes tertiaires tient « à l'introduction de signes subjectifs tels que des douleurs articulaires, une fatigue, un mal de dos, des troubles de la mémoire. C'est invérifiable. Une sérologie négative ne suffit pas à écarter le problème, une sérologie positive peut correspondre à une cicatrice sérologique sans que les symptômes soient en rapport ». Mais pour le Pr Perronne, il est important de considérer le diagnostic car ces patients souvent multi-explorés finissent par être orientés à tort en psychiatrie.

Dans son rapport de 2014, le HCSP indique qu'un traitement par tétracycline peut être tenté en cas de maladie de Lyme suspectée avec sérologie négative. « En l'absence de réponse satisfaisante, il ne sera pas proposé de traitement antibiotique et le patient sera réorienté », est-il recommandé. En cas de « borréliose de Lyme évoquée par le patient » et si la clinique est « incompatible » et la sérologie « négative »., un autre diagnostic devra être recherché.

Le Pr Perronne, tout comme l'ILADS, préconise des traitements prolongés et alternatifs sur des mois en cas de réponse initiale après quelques semaines de traitement. La non réponse à une antibiothérapie d'épreuve doit faire reconsidérer le diagnostic. Le spécialiste français revendique 80 % de réussite chez ses patients qu'il porte à bout de bras dans des consultations sursaturées : la seule façon de venir à bout de la maladie est de proposer des cures prolongées d'antibiotiques (3 mois) à la carte en alternance avec d'autres antibactériens comme des antifongiques, des antiparasitaires, du Plaquenil ou de la phytothérapie. « Il faut essayer des molécules, en changer, alterner et persévérer malgré les rechutes ou les aggravations transitoires, qui sont le signe d'une réaction au traitement », explique-t-il. L'étude publiée dans le « New England Journal of Medicine » en mars 2016 (Berende et al.) qui conclut à l'absence de bénéfice des traitements prolongés par rapport au placebo n'entame en rien sa conviction. « C'est le modèle d'études conçu pour ne montrer aucun résultat, argumente-t-il. En effet, à 3 mois, beaucoup de malades sont dans un état aggravé par rapport à leur état de base du fait des exacerbations de la maladie ».

Un besoin urgent de recherche

Le Pr Bricaire, dont il a été l'élève, dit ne pas le suivre : « Il est possible que la responsabilité soit immunologique plutôt qu'infectieuse. Dans ce cas des immunomodulateurs seraient plus indiqués. Le traitement antibiotique doit être justifié, j'ai beaucoup de mal à adhérer à ce type de propositions sur des mois ».

D'autres comme le Pr Berche plaident que « face au caractère polymorphe des signes pseudo-psychiatriques et neurologiques, il est indispensable de s'appuyer sur l'anamnèse et de rechercher la piqûre de tique » tout en mettant en avant « le besoin de tests moléculaires fiables pour confirmer directement les agents infectieux et justifier un traitement antibiotique sur plusieurs mois. L'absence de diagnostic laisse la place au fantasme ». La Haute Autorité de santé (HAS) vient d’être chargée par saisine de la DGS de « mettre à jour ses recommandations sur le traitement des formes avancées de la maladie »

Pour avancer, tous s'accordent sur la nécessité de promouvoir la recherche. Le Pr Perronne est le premier à réclamer que la recherche soit encadrée « dans des centres cliniques regroupant des médecins qui y croient », avec l'aide d'acteurs « ouverts d’esprit » impliqués dans la recherche humaine et animale (AVIESAN). Le Pr Bricaire insiste sur la réflexion à mener en amont et sur la nécessité d'études cliniques en double aveugle, quand le Pr Berche appelle à systématiser l'approche dans des groupes bien définis de patients mais aussi à faire des études en sciences humaines et sociales. Le Pr Jaulhac travaille au développement d'un test direct diagnostique par protéomique, « qui sera d'abord validé au stade précoce dans la peau ». L'Académie Nationale de Médecine va consacrer une séance spéciale à la maladie de Lyme en septembre

Des tests biologiques critiqués

07.07.2016

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Le rapport du HCSP de mars 2014 le soulignait : « La sérologie de la maladie de Lyme est principalement à l'origine des conflits (...) notamment dans le contexte dit de maladie de Lyme chronique ».

Tout le monde s'accorde sur le fait qu'à la phase primaire, face à un érythème migrant, le diagnostic est clinique et la sérologie inutile. La sensibilité de la sérologie n'est pas suffisamment bonne à ce stade, « de l'ordre de 50 % », précise le Pr Benoît Jaulhac, bactériologiste directeur du CNR.

Mais très vite les dissensions se font jour. Comme de nombreux pays européens, le HCSP recommande la stratégie en 2 temps. Pour le Pr Jaulhac, « si la sérologie est bien utilisée, c'est-à-dire n'est pas réalisée dans les formes primaires, soit la majorité des cas », la stratégie en deux temps, test quantitatif ELISA d'abord (anticorps IgG et IgM) puis test qualitatif de confirmation par Western blot (Ac IgM ou IgG) en cas d'ELISA positif ou douteux, est « satisfaisante, hormis dans les neuro-borrélioses où elle est négative au tout début et où il faut faire une analyse du LCR. Dans l'expérience du CNR depuis près de 10 ans, il n'existe pas d'arthrite ni d'acrodermatite chronique atrophiante avec sérologie négative ».

Conception et interprétation des tests en question

Ce n'est pas l'avis de beaucoup de praticiens, pour lesquels la sérologie est souvent prise en défaut. Le Pr Christian Perronne déplore « qu'il soit encore interdit en France de faire un Western blot (WB) en cas d'ELISA négatif », citant en exemple les CDC d'Atlanta, qui ont intégré la possibilité de faire un WB sans ELISA. Comme l'explique le Pr François Bricaire, « Le WB permet de statuer et on le fait de plus en plus même si l'ELISA est négatif. C'est un test intéressant s'il y a suffisamment de bandes positives et que l'interprétation par le biologiste est fine ».

Les détracteurs de la sérologie dénoncent deux biais majeurs, à la fois l'étalon choisi arbitrairement pour le calibrage (hypothèse de la présence de borréliose pour 5 % d'une population saine) et la recherche longtemps limitée à une seule Borrelia et comptant aujourd'hui trois espèces au total. « Il existe une vingtaine de souches mais c'est la souche B31 "Coca-Cola" qui a été retenue au départ, seules deux souches présentes en Europe ont été rajoutées, tout est pipé. Pour ma part, je ne regarde plus les résultats des sérologies », estime le Pr Perronne. Pour une souche telle que Borrelia myamotoi initialement identifiée au Japon puis en Russie, la sérologie est négative et le diagnostic est posé sur la recherche directe de la bactérie par PCR dans le sang.

Cependant le Pr Jaulhac, affirme : « Il existe très peu de Lyme en Europe et en France dues à d'autres espèces que les 3 principales pathogènes. Et les communautés antigéniques entre elles suffisent à positiver la sérologie ».

Un problème d'interprétation

Pour la SPILF et comme le relève le Pr Bricaire, le problème se situe au niveau de l'interprétation des tests par les laboratoires, « sujette à une grande variabilité » reconnaît le rapport du HCSP. Les Allemands, qui font plus facilement le diagnostic, font-ils mieux que nous ? « En Allemagne, les tests sont qualifiés de plus sensibles, commente le Pr Bricaire. Mon opinion, c'est qu'il existe aussi une certaine forme de dérapage. ».

Au sujet des tests, l'Agence du médicament (ANSM) devrait finaliser une étude documentaire des réactifs de diagnostic de la borréliose de Lyme, « à paraître au plus tôt en septembre », et plus vraisemblablement « en fin d'année ». Et pour ce qui est de l'activité des biologistes et de leur interprétation des tests, après un premier contrôle national de qualité (CNQ) auprès de 525 laboratoires (rapport publié en novembre 2014), « des recommandations ont été envoyées aux responsables des laboratoires », indique la direction générale de la santé (DGS).

Entre associations et médecins, un dialogue dans l'impasse

À la phase primaire, l'érythème migrant permet le diagnostic qui...
Crédit Photo : PHANIEZoom

Le 29 juin dernier, à l'issue d'une réunion avec les associations*, la ministre de la Santé a annoncé la présentation dès le mois de septembre d'un plan national d'action pour « renforcer la prévention de la maladie, améliorer la prise en charge des malades et associer l'ensemble des parties prenantes ». Les plus hautes instances sanitaires ont été sollicitées : l'agence nationale de sécurité du médicament (ANSM) devrait publier une évaluation des tests diagnostiques à l'autonome, l'AVIESAN doit approfondir la recherche, la Haute autorité de santé (HAS) devrait mettre à jour ses recommandations sur les formes avancées de la maladie, et Santé publique France, diffuser des plaquettes à destination du grand public et des professionnels de santé.

Cette litanie d'annonces, listées dès le rapport du Haut conseil de santé publique (HCSP) de décembre 2014, suffira-t-elle à apaiser les polémiques autour de la maladie de Lyme et à enclencher un dialogue entre les associations et le corps médical ?

Témoignages vs science

Si elle grondait depuis la conférence de consensus de 2006, la polémique éclate en 2012 lorsque Viviane Schaller, gérante d'un laboratoire d'analyses strasbourgeois et Bernard Christophe, diplômé en pharmacie sont traînés devant la justice, qui peine et demande un complément d'enquête. En 2014, les deux prévenus sont condamnés à 9 mois de prison avec sursis pour escroquerie à l'assurance-maladie pour la première et exercice illégal de la pharmacie pour le second. Un procès en appel doit se tenir en octobre. L'affaire a d’ores et déjà creusé les lignes de front.

Les tenants du consensus de 2006, les Pr Benoît Jaulhac et Daniel Christmann, ont défendu à la barre la validité des protocoles officiels. À front renversé, l'association Lyme Sans frontières, créée en 2012 par l'ancienne pilote de ligne devenue naturopathe Judith Albertat, soutient ceux qu'elle considère comme des lanceurs d'alerte. Moins directement, d'autres voix s'élèvent pour dénoncer la« sous-estimation dramatique de la maladie », comme le Pr Christian Perronne (CHU de Garches, membre du HCSP), critiquer les tests et les traitements et demander la reconnaissance de la forme chronique de la pathologie, comme France Lyme.

Les parties prenantes campent sur leurs positions. Au-delà de quelques médecins qu'elles soutiennent, les associations, qui se fondent sur des témoignages de patients, « concentrent leurs attaques sur le corps médical, et placent le pouvoir politique en position d'arbitre », analyse le HCSP, voyant là une différence majeure par rapport aux militants de la lutte contre le VIH. Les partisans du consensus de 2006 répliquent, eux, en parlant de dérive sectaire. « La conflictualité paraît inhérente à la question de la maladie de Lyme (...) Nous sommes à des années-lumière d'un dialogue pourtant nécessaire », résume le HCSP. Et de suggérer une meilleure prise en compte des récits (notamment en les soumettant à des recherches anthropologiques et sociolinguistiques), parallèlement à la professionnalisation des associations.

Effet d'annonce ?

En février 2015, alors qu'une proposition de loi UMP visant à mieux lutter contre la maladie venait d'être écartée, le gouvernement s'engageait à saisir les acteurs de la recherche avant l'été. La promesse d'un plan à l'automne 2016 pourrait n'être « qu'un effet d'annonce, une façon d'endormir les malades », redoute Me Catherine Faivre. Avec Me Julien Foucray, elle déposera en septembre devant le tribunal de grande instance de Lyon et peut-être de Paris une action regroupée de plus de 250 patients (Lyme action) contre les laboratoires producteurs de tests diagnostiques.

*La Fédération française contre les maladies vectorielles à tiques (FFMTV), Lyme sans frontières (LSF), France Lyme, Lymp'act, et Le relais de lyme ont été reçus avenue Duquesne le 29 juin.

Question sur les co-infections

07.07.2016

La question des co-infections par d'autres agents transmis par les tiques met également le diagnostic en défaut, faute de tests spécifiques disponibles en pratique. « Ce sont d'autres bactéries connues des laboratoires vétérinaires comme les dizaines d'espèces Bartonellae, les Erlichiae, les Rickettsiae, les Neoerlichiae mais aussi des parasites comme les Babesiae. Charles Nicolle, prix Nobel au début du XXe siècle, disait déjà que les infections inapparentes peuvent être responsables de processus inflammatoires chroniques », explique le Pr Peronne. Patrick Berche partage cet avis : « Les tiques abritent de nombreux micro-organismes dans l'intestin. Il y a une méconnaissance de maladies proches. » Toutefois, tempère le Pr Bricaire, « la mise en évidence d'infections associées ne suffit pas, encore faut-il prouver leurs responsabilités en clinique ».

En Allemagne, « trop de méthodes d'évaluation imparfaites »

Denis Durand de Bousingen

Beaucoup plus répandue outre-Rhin qu’en France, la maladie de Lyme est aussi mieux connue des médecins comme du grand public.

Selon les statistiques épidémiologiques allemandes, entre 60 000 et 100 000 personnes par an seraient infectées chaque année par la borréliose de Lyme, soit deux à quatre fois plus que les chiffres enregistrés en France. La maladie fait l’objet de nombreuses mesures de prévention. Dans les forêts allemandes et autrichiennes, des panneaux rappellent aux promeneurs les dangers des tiques, et les médecins comme les pharmaciens font de la prévention auprès du public.

En 2008, l’Allemagne s’est dotée d’un centre de référence national sur la maladie de Lyme, installé au sein du ministère régional de la santé de Bavière, à Erlangen. Il contribue à la formation continue des médecins et des biologistes, avec des séminaires et des conférences, mais effectue aussi des examens diagnostiques à leur demande, ainsi que des recherches médicales, biologiques et épidémiologiques. Son directeur, le Dr Volker Fingerle, estime que, malgré tous ces travaux, le besoin d’information et de formation reste élevé en Allemagne.

« Trop de méthodes d’évaluation imparfaites »

Les traitements font l’objet de protocoles officiels, supervisés par l’Institut Robert Koch, le centre national de prévention des maladies infectieuses, avec notamment une antibiothérapie qui ne doit pas excéder deux à trois semaines. Certains comme en France préconisent des traitements antibiotiques beaucoup plus longs, mais cette position est contestée par les principaux organismes scientifiques et médicaux.

Par ailleurs, dans certaines régions, les patients ont le choix de se faire soigner soit par un médecin officiel, soit par un naturopathe exerçant légalement des thérapies alternatives et complémentaires. En 2013 toutefois, la borréliose de Lyme est devenue, en Bavière et dans les six Länder de l’ancienne RDA, une maladie à déclaration obligatoire, ce qui a pour conséquence indirecte que les soignants non médecins, dont les naturopathes, n’ont plus le droit de traiter eux-mêmes cette maladie, et doivent transmettre leur patient à un médecin s’ils la découvrent chez lui. Le Dr Fingerle déplore le manque de rigueur et de sérieux de certains praticiens, médecins ou non. De plus, selon lui, « trop d’analyses sérologiques insuffisantes et trop de méthodes d’évaluation imparfaites, dont des tests de transformation des lymphocytes et des tests urinaires antigènes, ont amené ces dernières années à associer à la borréliose de Lyme de nombreux symptômes mal définis, comme la fatigue chronique ou la fibromyalgie ».

La tique, un réservoir de pathogènes

Betty Mamane

| 07.07.2016

« Au niveau mondial, les tiques sont considérées comme le deuxième vecteur arthropode de maladies infectieuses après les moustiques »,rappelle Muriel Vayssier-Taussat, directrice de recherche à l'École nationale vétérinaire de Maisons-Alfort (UMR BIPAR, INRA-ANSES-ENVA).

La famille la plus représentative est celle des Ixodidae dont une dizaine d'espèces en France et en Europe transmettent des maladies à l'homme. Parmi elles, Ixodes ricinus, responsable de la maladie de Lyme, est la plus largement répandue et vectrice du plus grand nombre d'agents pathogènes. Elle se nourrit sur plus de 300 hôtes différents et peut être infectante pour l'homme à tous les stades de son développement : soit à l'état de larve, nymphe ou adulte. Cette espèce de tiques est vectrice outre de Borrelia burgdorferi, à l'origine de la maladie de lyme, d'une demi-douzaine de borélia et autres bactéries telles que Anaplasma phagocy-tophilum,Candidatus Neoehrlichia mikurensis, Coxiella burnetii… L'un de ces agents pathogènes les plus redoutables étant le virus de l’encéphalite à tique. « Mais la zone de prévalence de cette infection grave reste relativement circonscrite dans l'Est de la France, il existe un vaccin efficace et les populations sont bien informées », précise Muriel Vayssier-Taussat.

Rhipicephalus sanguineus, autre tique de la famille des Ixodae, appelée également la tique du chien, sévit quant à elle dans le sud de la France. Elle peut être porteuse de Rickettsia Comorii une bactérie à l'origine de la fièvre boutonneuse médittérannéenne. « une maladie mortelle, mais qui se soigne très bien par un traitement antibiotique, à condition d'en reconnaître les symptômes », indique le Pr Parola, directeur en entomologie médicale et chef du service des maladies infectieuse de l'hôpital de la Timone de Marseille. À savoir : fièvre, boutons et une croûte noire significative à l'endroit où la tique est restée attachée.

Signes cliniques peu spécifiques

La majorité de ces agents pathogènes sont à l’origine de signes cliniques peu spécifiques (fièvres, douleurs musculaires, fatigue, etc.). Ils sont en fait difficilement détectables car très peu connus et sont donc très rarement diagnostiqués. Même si, comme le souligne le Pr Parola : « Depuis une dizaine d'années, la médiatisation autour de la maladie de lyme a eu l'avantage de sensibiliser les médecins qui détectent plus souvent les premiers signes de ces maladies et l'on voit moins de diagnostics tardifs ».

Reste que les tiques sont susceptibles de co-transmettre simultanément plusieurs agents pathogènes à l’homme. « On peut retrouver jusqu'à 5 différents agents pathogènes pour l'homme dans une même tique, signale Muriel Vayssier-Taussat. Mais l’impact de ces associations microbiennes reste encore méconnu, y compris en termes de symptomologie. Ce qui complique le diagnostic et le traitement ». Et d'ajouter qu'au-delà de la maladie Lyme, d'autres pathologies sont à explorer qui ne sont pas anecdotiques : « La recherche doit se poursuivre pour répondre aux préoccupations de ces personnes qui présentent des symptômes après s'être fait piquer par des tiques et qui restent négatifs aux tests de cette maladie. » Son laboratoire attend pour cela le feu vert de l'Agence nationale de la recherche (ANR) pour le lancement d'une vaste étude en partenariat avec les services d'infectiologie de 7 CHU*.

*Besançon, Strasbourg, Rennes, Saint-Etienne, Bichat-Claude-Bernard (Paris), Garches, Clermont-Ferrand

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