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11 novembre 2014 2 11 /11 /novembre /2014 07:42
Épigénétique et Lithium Recherche sur les cellules (2011) 21: 1424-1435. doi: 10.1038 / cr.2011.108; publié en ligne le 5 Juillet 2011 Le lithium, un médicament anti-dépressuer, qui améliore considérablement la production des cellules souches pluripotentes induites. Quan Wang1, Xinxiu XU2, Jun Li3, Jing Liu4, Haifeng Gu1, Ru Zhang2, Jiekai Chen4, Yin Kuang5, Jian Fei5, Cong Jiang6, Ping Wang6, Duanqing Pei4, Sheng Ding3 et Xin Xie1,2 1State Laboratoire clé de recherche sur les drogues, le Centre national de dépistage des drogues, Shanghai Institute of Materia Medica de l'Académie des Sciences de Chine, Shanghai 201203, Chine 2Shanghai Laboratoire clé de la signalisation et recherche sur les maladies, Laboratoire de Bio-médecine fondée sur des récepteurs, École des sciences de la vie et de la Technologie, l'Université de Tongji, Shanghai, Chine 3Département de chimie, The Scripps Research Institute, 10550 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, USA 4Tapez Laboratoire de biologie régénérative, l'Institut sud de la Chine pour la biologie des cellules souches et la médecine régénérative, Guangzhou Instituts de la biomédecine et de la santé, de l'Académie chinoise des sciences, Guangzhou, Chine Centre de recherche pour 5Shanghai Biomodel organisme, Shanghai, Chine 6Institute des sciences biomédicales et de l'École des sciences de la vie, East China Normal University, Shanghai, Chine Correspondance: Xin Xie, Tél: + 86-186-0211-0377 E-mail: xxie@mail.shcnc.ac.cn Reçu le 13 Avril 2011; Révisé le 19 mai 2011; Accepted 1 Juin 2011; Publié en ligne le 5 Juillet de 2011. Résumé Les cellules somatiques peuvent être reprogrammées en cellules souches pluripotentes induites (CISP) par des facteurs définis. La faible efficacité de la reprogrammation et l'intégration génomique des oncogènes et des vecteurs viraux a limité l'application potentielle des CSPi. Nous rapportons ici que le lithium (Li), un médicament utilisé pour traiter les troubles de l'humeur, améliore grandement la production de CSPI à partir de deux sources, des fibroblastes embryonnaires de souris et des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine. Li facilite la génération des iPSC avec un (Oct4) ou deux facteurs (OS ou OK). L'effet de Li sur la promotion de la reprogrammation ne dépend que partiellement sur sa cible principale GSK3, connue en psychiatrie. Contrairement à d'autres inhibiteurs de la GSK3ß, Li, non seulement il augmente l'expression de Nanog, mais augmente également l'activité transcriptionnelle de Nanog. Nous avons également constaté que Li exerce son effet par la promotion de modifications épigénétiques via la régulation négative de LSD1, une histone déméthylase spécifique de H3K4. Réduire LSD1 imite partiellement l'effet de Li dans l'amélioration de la reprogrammation. Nos résultats ne fournissent pas seulement une méthode simple pour améliorer l'efficacité de génération des iPSC, mais a permis également d'identifier une déméthylase d'histone, tel un modulateur critique pour la reprogrammation de cellules somatiques. Mots-clés: lithium; Les cellules souches pluripotentes induites; iPS; GSK3; Nanog; LSD1; histone déméthylase Introduction Le développement de l'animal à partir d'un ovule fécondé jusqu'à un individu complet est un processus programmé et a été considéré comme irréversible chez les mammifères. Récemment, un travail de pionnier a démontré que l'expression ectopique de facteurs de transcription définies (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin28) pourrait reprogrammer un modèle murin et des cellules somatiques humaines en cellules souches pluripotentes induites (CISP) 1, 2. Les cellules de Souris iPSCs sont similaires à CES pour la plupart des aspects, et peuvent se développer en individus après complémentation tétraploïde de technologie 3. Les iPSC ont attiré d'énormes intérêts en raison de leurs applications biomédicales. Les IPSCs spécifiques au patient pourraient être créées par la reprogrammation, et elles pourraient encore être différenciées en cellules autologues fonctionnelles pour la thérapie à base de cellules sans problèmes d'immuno-compatibilité ni préoccupations éthiques. Toutefois, les applications de cellules iPS sont entravées par des problèmes de sécurité en raison de l'utilisation d'oncogènes et d'incorporation de séquences d'ADN viral. Beaucoup d'efforts ont été entrepris pour que ces IPSCs se prêtent à des fins thérapeutiques, comme l'utilisation de la réduction du nombre de facteurs 4, la production de gènes de non-intégration des approches 5, ou rendre la membrane cellulaire des protéines perméables pour déclencher la reprogrammation 6. Cependant, l'efficacité de la reprogrammation est extrêmement faible dans ces conditions. Les petites molécules qui peuvent améliorer la production des iPSCs ou compenser la présence de certains facteurs oncogènes seront très précieuses. Elles peuvent non seulement améliorer l'efficacité de la reprogrammation, mais aussi aider à disséquer les mécanismes sous-jacents. Un certain nombre de produits chimiques ont été signalés permettant d'améliorer l'efficacité de la reprogrammation (revue par Li et al. 7), dont plusieurs agents de modulation épigénétiques, comme l'APV, 5'-AZA et BIX-01294, et plusieurs inhibiteurs de la voie de signalisation majeures, telles que CHIR99021, PD0325901 et les inhibiteurs des récepteurs TGFß. Plus récemment, la vitamine C (Vc) a été signalée pour améliorer considérablement la reprogrammation de cellules somatiques par la réduction de la sénescence cellulaire 8. Dans notre recherche de composés qui améliorent l'efficacité de l'induction des iPSC, nous avons constaté que le lithium (Li), un médicament utilisé pour traiter les troubles de l'humeur, améliore grandement la reprogrammation à la fois dans des fibroblastes de souris embryonnaires (MEF) et dans les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC). Li facilite également la production d'un facteur (Oct4) -hiPSCs avec des combinaisons d'autres composés. Plusieurs mécanismes, y compris l'inhibition GSK3, une expression accrue de Nanog et l'activation et la régulation négative LSD1, ont été étudiés et montré leur rôle important dans l'amélioration par Li de la reprogrammation. Résultats Li favorise la reprogrammation de cellules MEF Nous avons établi un système de criblage chimique à base de 96 plaques pour les quatre facteurs (4F) de reprogrammation induite (figure 1A). Pendant la projection, nous avons montré que le traitement avec le stabilisateur de l'humeur chlorure de lithium qui est un médicament connu (LiCl) 9 a considérablement augmenté le nombre de cellules GFP + colonies. LiCl a montré le plus d'effet à 10 mM (figure 1B). Le Traitement par Li a non seulement augmenté le nombre de cellules GFP + colonies, mais a aussi permis de raccourcir le processus de reprogrammation. Au jour 8, ~ 10 GFP + colonies ont pu être observées dans Li traité puits (5 000 MEF / puits), tandis que le contrôle n'en avait presque aucun (figure 1C). Au jour 12, une analyse FACS a montré 10% des cellules étant des cellules GFP + (Figure 1D). Amélioration similaire de la reprogrammation a également été observée avec 3F (sans c-Myc) -transduced MEF, si le processus est légèrement plus lent que 4F. Au jour 14, environ 15 GFP + colonies ont pu être observées dans les puits Li-traités. Et les données FACS ont révélé un remarquable 14% de cellules GFP + étant à jour 16 (Figure 1J et 1K). Li augmente l'efficacité de reprogrammation des fibroblastes de souris. (A) Représentation schématique du protocole iPSC avec des produits chimiques. (B) Dose-réponse de Li dans 5 000 MEF avec 4F-infection. Les valeurs moyennes ± SEM d'une expérience représentative sont présentés, n = 3. (C) Haut: images représentatives de la GFP + colonies dans des plaques à 96 puits. Les MEF 4F infectées ont été traitées avec l'APV (1 mM) ou LiCl (10 mM). Les cellules ont été fixées à jour 10. Barre d'échelle: 6 mm. En bas: GFP + clonies de 5 000 MEF 4F-infectés en présence de LiCl ou APV. Les valeurs moyennes ± SEM d'une expérience représentative sont présentés, n = 3. (D) A gauche: FACS représentatifs parcelles au jour 12 de 4F-infectés traités par MEF LiCl (10 mm). Signal provenant du canal PE a été utilisé comme contrôle pour l'autofluorescence. A droite: les données statistiques de la GFP + pourcentage de cellules dans les MEF 4F-infectés traités par Li (10 mm) mesurée par FACS. Les valeurs moyennes ± SEM de trois expériences indépendantes sont présentés. (E) Moment d'action Li. LiCl (10 mM) a été ajouté pour 3 jours à partir du jour 3, 6 et 9 dans MEF 4F-infectés et GFP + clonies ont été comptés au jour 16. Les valeurs moyennes ± SEM d'une expérience représentative sont présentés, n = 3. (F) La durée du traitement de Li. A partir de trois jours, les MEF 4F infectées ont été traitées avec 10 mM de LiCl pendant différentes durées et les colonies GFP + ont été comptés au jour 16. NaCl (10 mM) a été ajouté au jour 3 à 14 en tant que témoin négatif. Les valeurs moyennes ± SEM d'une expérience représentative sont représentées, n = 3. (G) MEF-4F infectées ont été traitées avec APV, LiCl, ou une combinaison des deux. GFP + colonies ont été mesurés au jour 8. Les valeurs moyennes ± SEM d'une expérience représentative sont représentées, n = 3. MEF (H) 4F-infectées ont été traitées avec Vc, LiCl, ou une combinaison des deux dans un milieu MES. GFP + ont été mesurées à clonies jour 12. Les valeurs moyennes ± SEM de trois expériences indépendantes sont présentés. (I) l'effet de Li en milieu ISF1. Les valeurs moyennes ± SEM d'une expérience représentative sont représentées, n = 3. Effet de (J) Li dans MEF 3F-infecté. GFP + clonies ont été mesurées à jour 14. Les valeurs moyennes ± SEM d'une expérience représentative sont présentés, n = 3. (K) FACS représentatifs parcelles à jour 16 de MEF 3F-infectés traités avec LiCl (10 mm). * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, par rapport au témoin. Li a été rapporté à réguler la prolifération des cellules souches comme dans le rétinoblastome 10. Les produits chimiques qui améliorent l'auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires, comme PD0325901 et CHIR99021, ont également été signalés à améliorer la génération de colonies iPS 7. Pour préciser si Li facilite le processus de reprogrammation ou améliore la prolifération des CSPi après reprogrammation, nous traitons les cellules MEF 4F transduites avec LiCl pendant 72 h à partir du jour 3, 6, 9. Nous avons constaté que le début du traitement Li au jour 9 n'a eu aucun effet évident sur l'efficacité globale. En revanche, on observe une augmentation de 5 et 2,5 fois statistiquement significative du nombre de colonies GFP + dans les cultures traitées avec Li à partir du jour 6 et 3, respectivement (Figure 1E). Nous traitons également les cellules MEF 4F transduites avec LiCl pour différentes durées à partir du jour 3. Nous avons constaté que le stade précoce de la reprogrammation (jour 3-8) était la plus critique pour les effets Li, comme traitement prolongé Li n'a pas augmenté davantage la efficacité (figure 1F). En fait, un traitement prolongé de Li provoqué la réduction de la taille des colonies et la réduction éventuelle du nombre de colonies (données non présentées), ce qui indique un effet cytotoxique. Nous avons donc décidé que la durée de traitement doit être 3-8 jours. NaCl à 10 mM affichée aucun effet d'amélioration, ce qui indique que Li est la composante efficace (figure 1F). Ces données indiquent que Li favorise la production de colonies iPS en facilitant le processus de reprogrammation plutôt que d'accroître la prolifération des cellules iPS. Suivant nous avons testé LiCl en combinaison avec deux amplificateurs de reprogrammation signalés, APV et Vc. La combinaison de LiCl et APV affiche un effet additif (figure 1G), ce qui suggère qu'ils agissent par des mécanismes différents. Comme le supplément KSR contient déjà Vc et Vc supplémentaire ne ajouter un effet à l'efficacité globale de reprogrammation (11 et notre propre observation), la combinaison de LiCl et Vc ont été testés dans mES milieu supplémenté avec du FBS. Le processus de reprogrammation a été beaucoup plus lent et l'efficacité est beaucoup plus faible en milieu mES rapport à moyen KSR. Au jour 12, les deux Vc et LiCl ont montré effet marginal dans le renforcement reprogrammation sur leur propre. A notre grande surprise, la combinaison des deux fait fait preuve d'un effet synergique solide (Figure 1 H), ce qui suggère la diaphonie des voies ou des cibles régulés par ces deux petites molécules. Récemment, un milieu optimisé (ISF1) pour la reprogrammation des cellules somatiques de souris a été rapporté 12, qui utilise KSR complété avec 1/200 N2 et 5 ng / ml de bFGF. Par rapport à notre milieu KSR standard, ISF1 améliore considérablement l'efficacité de la reprogrammation de base 4F-induite. Au jour 8, plus de 10 GFP + colonies ont pu être observées à partir de la commande et, comparativement à près de zéro en milieu KSR (figure 1E, 1C et 1G). Li affiche encore une amélioration dépendant de la dose de l'efficacité de reprogrammation en milieu ISF1 avec un effet maximal à 10 mM (~ 6 plis), et le pli d'augmentation demeure dans un milieu semblable au KSR (figure 1I et 1B). Ce résultat indique que l'effet bénéfique de Li ne se chevauche pas avec N2 et bFGF. Cellules reprogrammées avec Li sont pluripotentes Pour vérifier si l'efficacité de reprogrammation renforcée par Li pourrait finalement entraîner dans les cellules iPS de bonne foi, nous avons généré une série de lignées cellulaires iPS en utilisant la 4F ou 3F, plus LiCl méthodes en sélectionnant les colonies GFP +. analyse qPCR confirmé la réactivation et l'expression endogène de la souris Oct4, Sox2, Nanog et Rex1 (figure 2A), et la réduction au silence de gènes viraux (figure 2B). PCR de l'ADN génomique de 3F-iPSCs a confirmé l'intégration rétrovirale de Oct4, Sox2 et Klf4, mais pas de c-Myc (figure 2C). Ces cellules iPS maintenir GFP + et morphologie ES-like. L'immunocytochimie a révélé qu'elles expriment des marqueurs de la pluripotence typiques, tels que la phosphatase alcaline (AP), SSEA1 et Nanog (4F clone 1-1 de la figure 2D et clone 3F-8 dans l'information complémentaire, la figure S1A). Pluripotence des cellules iPS dérivées de MEF avec traitement Li. (AB) L'analyse qPCR de gènes de pluripotence et transgènes exogènes dans quatre clones 4F-IPS et quatre clones 3F-iPS généré avec Li. lignée de cellules mES E14, MEF MEF et infectés par 4F pendant 4 jours (MEF-4F (D4)) ont été utilisés comme témoins. (C) Analyse par PCR pour confirmer l'absence d'intégration dans c-Myc-3F iPSC clones. (D) Haut: morphologie, expression de la GFP et la coloration AP dans iPSC clone 4F 1-1. Moyen et faible: coloration par immunofluorescence de gène de la pluripotence AESS-1 et Nanog dans le même clone. Barre d'échelle: 50 pm. Analyse (E) caryotype de clone 4F 1-1. (F), il taché sections de tératomes formés avec clone 4F 1-1. Structures typiques des trois feuillets embryonnaires sont présentés: l'épiderme (ectoderme), les muscles et le cartilage (mésoderme) et l'épithélium (endoderme). Barre d'échelle: 50 pm. (G) A gauche: une souris chimérique produit iPSC clone 4F 1-1 et sa progéniture couleur agouti. A droite: les souris chimériques produites avec iPSC clone 3F-8. L'analyse du caryotype a révélé que le clone 4F 1-1 a la normale 40, les chromosomes XX (figure 2e). Injection sous-cutanée des cellules iPS dans des souris SCID a conduit à la formation de tératome en 3-4 semaines, contenant des tissus issus de l'ensemble des trois couches germinales, notamment la structure de l'épiderme (ectoderme), le muscle et la structure du cartilage (mésodermique), et la structure de tube de l'épithélium (endoderme) (Figure 2F et de l'information supplémentaire, figure S1B). Nous avons ensuite examiné la capacité des cellules iPS Li-induites à produire des chimères adultes. Les cellules iPS (clone 4F 1-1, 4-1 et 4F 3F-8) ont été injectées dans des blastocystes ICR-dérivés, qui ont été transplantés dans l'utérus de la souris pseudo. Nous avons obtenu chimères adultes des trois clones tel que déterminé par la couleur du pelage (figure 2G et informations complémentaires, tableau S2). Nous avons ensuite traversé une des chimères de clone 4F 1-1 ICR mâle. Quatre du total des 16 souris F1 montré la couleur du pelage agouti, confirmant la transmission germinale de iPS clone 4F 1-1 (figure 2G). Li augmente la production de cellules de souris et humaines iPS avec un ou deux facteurs La production de cellules de souris et iPS humaines avec des facteurs réduits combinés avec de petites molécules a été rapporté 13, 14, 15. On a testé Li (5 mM), en combinaison avec l'APV (0,5 mM) et RepSox (1 uM) dans OK médiée par reprogrammation dans MEF. Au jour 18, un seul GFP + colonie n'a pu être trouvée sur 150 000 MEF de OK transduction traitées avec VPA et RepSox. Cependant, avec Li, environ 30 colonies GFP + ont été identifiés (figure 3B). Les cellules traitées avec VPA et RepSox également développé des structures de colonies comme, mais la plupart ont pas exprimé Oct4-GFP Lithium améliore la production de cellules de souris et humaines iPS avec un ou deux facteurs. (A) 2F (OK) MEF infectés par ont été traités avec mM VPA 5 et 1 uM RepSox en combinaison avec mM LiCl 5 ou pas. VPA et LiCl ont été ajoutés de jour 3-13. Des Colonies représentatives ont été photographiés à jour 18. Barre d'échelle: 50 pm. (B) Nombre de GFP + colonies sur 150 000 à partir OK MEF a été compté à jour 18. (C, D) 2 000 000 OS- (C) ou Oct4-infectées (D) des cellules HUVEC dans les plats de 10 cm ont été traités avec des combinaisons de composés (y compris 0,5 uM A83-01, NaB 0,25 mM, 5 uM PS48, 3 uM et 0,5 uM CHIR PD0325901) en présence de LiCl 5 mM ou non. Pour la reprogrammation du système d'exploitation et sa médiation, LiCl ont été ajouté à partir de 3-14 jours; pour la reprogrammation de Oct4 médiation, LiCl ont été ajouté à partir de 3-18 jours. Les autres composés ont été ajoutés à partir de 3 à 21 jours (C) ou de jours de 3 à 28 (D). Colonies colorées positif par Alexa Fluor 555 souris anti-anticorps humain TRA-1-81 ont été comptés au jour 28 (C) et 35 (D). Les valeurs moyennes ± SEM d'une expérience représentative sont représentées, n = 3. * P <0,05, ** P <0,01, par rapport au témoin. (E, F) immunofluorescence de marqueurs de pluripotence Nanog et SSEA4 à OK-hanches (E) et Oct4-hanches (F) clones. Barre d'échelle: 50 pm. Les combinaisons chimiques qui ont facilité le succès d'un facteur (Oct4) reprogrammation induite dans les cellules de souris et humaines sont quelque peu différents. Nous sommes également intéressés à tester si les effets positifs de Li dans la souris générant des iPSC sont similaires dans les cellules humaines. Deux millions OS- (figure 3C) ou Oct4 infectées (Figure 3D) des cellules HUVEC ont été ensemencées dans des boîtes de 10 cm et traités avec des combinaisons de composés (y compris 0,5 uM A83-01, NaB 0,25 mM, 5 uM PS48, 3 uM CHIR et 0,5 uM PD0325901) en présence de LiCl 5 mM ou non. Pour la reprogrammation du système d'exploitation médiation, Li a été ajouté à partir de 3-14 jours; pour la reprogrammation de Oct4 médiation, Li a été ajouté à partir de 3-18 jours. Les autres composés étaient présents à la longueur de la reprogrammation jusqu'à une semaine avant le comptage de colonies et la cueillette. Li a doublé l'efficacité de reprogrammation par rapport aux combinaisons de base de composés à la fois OS- ou Oct4 médiation génération de hiPSC (figure 3C et 3D). TRA-1-81 + colonies ont été prélevées, réensemencés et caractérisé en outre par immunofluorescence. Les deux OK-hiPSC (figure 3E) et Oct4-hiPSC (figure 3F) clones a montré une coloration positive pour les marqueurs de pluripotence Nanog et SSEA4. Ces résultats indiquent que Li ne favorise pas seulement la reprogrammation des facteurs réduits, mais fonctionne également bien dans l'induction de cellules iPSC humaines. La mise en valeur de Li dans la production d' iPSC est seulement partiellement médiée par l'inhibition de la GSK3 Li est bien connu pour inhiber la GSK3ß 16. inhibiteurs de GSK-3β peuvent maintenir l'état non différencié de cellules humaines et de souris ES via l'activation de la signalisation Wnt 17. Une étude récente a montré que l'inhibition double (2i) de MAPK et de GSK3ß favorise la reprogrammation des cellules somatiques efficacité 18. Par conséquent nous avons comparé l'effet de Li avec trois inhibiteurs de GSK3ß (BIO, CHIR99021 et SB415,286). Nous avons constaté que BIO et SB415,286 ne présentent pas d'effet notable dans notre système à des concentrations couramment appliqués, tandis que CHIR99021 affiche effet bénéfique marginal à 3 pm (figure 4A). Comme l'inhibition de la GSK3ß conduit à la stabilisation et à l'activation de β-caténine et de TCF-dépendante la transcription des gènes 19, nous avons utilisé un système rapporteur de la luciférase de TopFlash pour comparer l'effet inhibiteur de ces produits chimiques sur la GSK3ß. Tous les quatre composés inhibaient la GSK3, CHIR99021 et BIO font légèrement mieux leur effet inhibiteur sous Li Participation de la GSK3, Nanog et LSD1 dans l'effet de Li de la promotion de reprogrammation. (A) MEF de OKSM infectés ont été traités avec des inhibiteurs de GSK3ß (CHIR99021, SB415286 et BIO) et IMPase inhibiteur L690,488, et GFP + colonies ont été comptées. Les valeurs moyennes ± SEM d'une expérience représentative mesuré en triple exemplaire sont présentées. * P <0,05, par rapport au témoin. (B) activation de la voie Wnt par les inhibiteurs de GSK3ß. Des cellules 293T ont été transfectées avec 8 x TopFlash reporter et traités avec des inhibiteurs différents de GSK3ß. Les valeurs moyennes ± SEM de trois expériences indépendantes sont présentés. * P <0,05, ** P <0,01, *** p <0,001. MEF (C) OKSM infectées ont été traitées avec LiCl ou la combinaison de l'inhibiteur de GSK3 (CHIR99021) et l'inhibiteur de IMPase (L690,488) et GFP + colonies ont été comptées. Les valeurs moyennes ± SEM d'une expérience représentative mesuré en triple exemplaire sont présentées. * P <0,05, ** P <0,01, par rapport au traitement de LiCl. (D) Nanog journaliste activation par les inhibiteurs de GSK3ß. Des cellules 293T ont été transfectées avec une construction de rapporteur contenant la région promoteur de Nanog (P5N nanog rapporteur) et traités avec du LiCl et CHIR99021. Les valeurs moyennes ± SEM de trois expériences indépendantes sont présentés, * P <0,05, par rapport au témoin. Analyse (E) qPCR d'expression Nanog lors de la génération dans les cellules iPSC MEF OKSM-infectés traités avec ou sans LiCl. Les niveaux d'expression ont été normalisés en utilisant GADPH et des valeurs moyennes ± SEM de trois expériences indépendantes sont présentés. * P <0,05, par rapport au témoin. (F, G) Amélioration de Nanog activité transcriptionnelle par Li. Des cellules 293T ont été transfectées avec une construction de rapporteur contenant l'élément de réponse Nanog (Nanog5P rapporteur) en présence ou non de Nanog, puis traitées avec LiCl ou CHIR99021. Les valeurs moyennes ± SEM de trois expériences indépendantes sont présentés, * P <0,05, ** P <0,01, par rapport au témoin. (H) western blot Représentant pour détecter l'expression de LSD1 et la méthylation de H3K4 après traitement LiCl dans MEF. (I, J) une analyse statistique du niveau de LSD1 et H3K4 methylaiton avec western blot. Les valeurs moyennes ± SEM de trois expériences indépendantes sont présentés, * P <0,05, ** P <0,01, par rapport au témoin. (K) l'analyse par transfert de Western pour déterminer l'efficacité de LSD1 shRNA. Les lysats ont été extraites de cellules MEF deux jours après l'infection. (L, M) MEF ont été infectées par OKSM avec bousculade ou LSD1 shRNA. LiCl a été ajouté à la culture de 3-8 jours. GFP + colonies ont été comptées à 10 jours et 16. Les valeurs moyennes ± SEM d'une expérience représentative mesuré en triple exemplaire sont présentées. ** P <0,01, *** P <0,001, par rapport au témoin. Un autre objectif majeur de Li est l'inositol monophosphatase (IMPase) 20. Ainsi, nous avons mesuré l'efficacité de reprogrammation de L-690488, un autre inhibiteur de IMPase. Les résultats ont indiqué que la L-690488 n'a pas eu d'effet notable à des concentrations couramment appliquées (figure 4A). Combinaison de CHIR99021 et L-690488 légèrement amélioré l'efficacité de reprogrammation, mais leur effet est significativement inférieur à celui de Li (figure 4C). L'Étude précédente a également montré que le traitement par Li à long terme peut supprimer la P53 et à l'expression de Bax, mais augmenter Bcl-2 expression, ce qui joue un rôle important dans la neuroprotection 21. Des résultats récents suggèrent que l'inhibition de p53 et une partie de son expression du gène cible en aval peuvent prévenir la sénescence cellulaire et augmente de manière significative l'efficacité de reprogrammation 22. Toutefois, nous ne constatons un changement significatif dans les niveaux de p53 et Bcl-2 avec ou sans traitement Li que sur des protéines lors de la reprogrammation (information supplémentaire, figure S2), ce qui indique qu'ils ne sont pas impliqués dans l'effet bénéfique de Li dans la production de cellules iPSC. Pris ensemble, ces données suggèrent que la mise en valeur de Li dans la production d'iPSC peut ne dépendre que partiellement de l'inhibition de la GSK3. D'Autres objectifs recherchés de Li, comme sur IMPase, P53 et BCL-2, ne sont pas impliqués. Li augmente l'expression et l'activité transcriptionnelle de Nanog Nanog joue un rôle essentiel dans le maintien de l'état pluripotent des cellules ES 23. expression endogène de Nanog est considéré comme essentiel pour l'induction réussie de CSPi. L'activation de la voie Wnt / β-caténine, ou l'inhibition de la GSK3ß a été rapporté pour augmenter Nanog expression 24 et Li a été rapporté pour augmenter l'expression Nanog dans certaines cellules souches analogue 10. L'utilisation d'un système rapporteur de luciférase (Addgene # 16337) contenant Nanog région de promoteur, on a constaté que le traitement par Li active de façon significative (~ 2 plis) l'effet du promoteur de Nanog dans des cellules HEK293T. CHIR99021 et active aussi de manière significative le promoteur Nanog, bien que dans une moindre mesure (figure 4D). Au cours de la reprogrammation 4F médiation, Li a également induit ~ 2 fois plus dans Nanog transcription de l'ARNm (figure 4E). Considérant que Nanog peut se lier à son propre promoteur et dans la forme d'auto-régulation en boucle 25, nous avons testé si Li qui peut augmenter l'activité transcriptionnelle de Nanog. Il est intéressant, en utilisant un système rapporteur contenant Nanog (site de liaison), élément de réponse à 26, nous avons trouvé que Li améliore de manière significative l'expression de rapporteur dans des cellules HEK293T co-exprimées avec Nanog. En revanche, CHIR99021 n'avait pas un tel effet (figure 4F). Li améliore expression du rapporteur et dépend de la présence de Nanog. Dans les cellules non transfectées avec Nanog, Li n'a eu aucun effet (Figure 4G). Ces résultats indiquent que Li peut augmenter l'expression du gène Nanog par l'inhibition de la GSK3ß. Mais différent des autres inhibiteurs de la GSK3ß, Li améliore également l'activité transcriptionnelle de Nanog. Li améliore la production d'iPSC en réduisant l'expression LSD1 Une étude récente a indiqué que Li a prolongé la durée de vie de C. elegans en réduisant l'expression d'actions LSD1 27. LSD1 d'homologie de séquence significative avec amine dépendante de FAD oxydases 28. Il a été découvert dans un certain nombre de complexes corépresseur, y compris CtBP, la BDNI , Co-REST et des sous-ensembles de la HDAC des complexes 28, 29, 30, et joue un rôle dans la répression de la transcription. Une étude récente a révélé que LSD1 est une histone déméthylase spécifique de la lysine et déméthyle spécifiquement l'histone H3 lysine 4 (H3K4) 31. Parnate®, un inhibiteur d'oxydase de type amine qui inhibe LSD1, est rapporté à promouvoir la reprogrammation en combinaison avec CHIR99021 7. Par conséquent, nous avons testé si LSD1 a été impliqué dans la reprogrammation Li améliorée. Li en traitement prolongé réduit de manière significative le niveau de protéines dans les cellules MEF LSD1 (Figure 4H et 4I). Pendant ce temps, l'ensemble du niveau de H3K4 génome de méthylation apparaît un peu mais notable augmentation (Figure 4H et 4J). L'effet de Li sur LSD1 ne passe pas par la GSK3, comme CHIR99021 n'a pas d'incidence sur le niveau de LSD1 dans MEF (de l'information supplémentaire, figure S3). Réduire l'expression de LSD1 avec shRNA a considérablement amélioré l'efficacité de la reprogrammation de 4F transduction MEF, mais l'amélioration n'a atteint environ 40% de Li est alors que la GFP + colonies ont été comptées à jour 10 et 16 (Figure 4K, 4L et 4M). La Combinaison de Li et LSD1 shRNA affiche un effet additif sur l'efficacité de la reprogrammation à un stade précoce (jour 10, figure 4L). Bien que dans le long terme (16 jours), la combinaison n'a pas montré une meilleure efficacité que Li seul (Figure 4M). Cela est probablement dû à l'effet lent sur LSD1 régulation négative médiée par Li ou shRNA seul. Combinaison des deux a accéléré ce processus et de raccourcir le temps de reprogrammation. Et la combinaison n'a pas montré une meilleure efficacité globale au jour 16 de Li seul, ce qui confirme que la régulation négative LSD1 seulement contribué en partie à la mise en valeur de Li de reprogrammation. Discussion Comme Li est l'élément le plus léger dans le tableau périodique (en dehors des 2 gaz He H) , les fonctions thérapeutiques de Li ont attiré de nombreux intérêts dans les domaines scientifiques. Les Sels de lithium ont commencé à être utilisés en thérapeutique dès le 19ème siècle et ont été utilisés pour le trouble bipolaire depuis la fin des années 1940. Li protège les neurones d'une variété de stimuli pro-apoptotiques in vitro et in vivo. Il facilite également le remodelage axonal et la croissance des neurites, ce qui pourrait aider à restaurer les fonctions neuronales (revue par 32). Li est un puissant stimulant de cellules souches de la moelle osseuse provoque une leucocytose bénigne. Il a été utilisé cliniquement pour rétablir l'équilibre des leucocytes à divers troubles hématopoïétiques. En augmentant le nombre de neutrophiles et éosinophiles, Li inhibe la production de lymphocytes T, et est parfois utilisé pour moduler les fonctions immunitaires (examinés par 9). Dans cette étude, nous avons découvert que Li peut améliorer la reprogrammation de cellules somatiques à CSPi. En ajoutant de LiCl dans le milieu de culture pendant une courte période de temps (3-8 jours), on peut obtenir iPSCs de haute qualité avec une efficacité supérieure à 10% dans les deux 4F- et 3F reprogrammation induite par MEF. Li a également amélioré deux facteurs (OS) - ou un facteur (Oct4) reprogrammation médiée dans HUVEC, indiquant que le mécanisme de son action pourrait être similaire dans les deux : chez la souris et dans le système humain. GSK3 est la cible la plus étudiée de Li. A notre grande surprise, la reprogrammation activateur rapporté CHIR99021 18, un inhibiteur de GSK3 synthétique, seulement affiché effet marginal dans le renforcement génération iPSC dans notre système. Ceci est probablement dû à la différence dans les milieux et suppléments utilisés dans diverses études de base, de sorte que l'activité de GSK3ß de base peut être différent. Néanmoins, cela indique que l'inhibition de la GSK3ß ne contribue en partie à l'effet de Li. Une expression accrue Nanog est l'un des effets en aval de la GSK3ß inhibition 24. Contrairement à d'autres inhibiteurs de la GSK3ß, Li, non seulement augmente l'expression de Nanog, mais augmente également l'activité transcriptionnelle de Nanog. Nanog peut se lier à son propre promoteur et forme autoregulatroy et anticipation des circuits 25, et Li peut améliorer cette réglementation d'anticipation. Cela peut expliquer en partie pourquoi Li fonctionne mieux que d'autres inhibiteurs de GSK3ß. Cela correspond aussi bien avec nos données que Li est plus efficace lorsqu'il est ajouté à partir de 6-9 jours, comme l'expression Nanog est un événement tardif par rapport au cours de reprogrammation. Li semble également exercer son effet en favorisant des modifications épigénétiques. Nous avons trouvé que le traitement Li prolongée réduit considérablement LSD1 niveau de protéines dans les cellules MEF. Pendant ce temps, l'ensemble du niveau de méthylation de H3K4 génome affiché une augmentation faible, mais notable, indiquant l'activation de la transcription génique. Réduire LSD1 conduit à une amélioration significative de l'efficacité de la reprogrammation, si l'effet bénéfique n'a atteint environ 40% de Li de. Cette condition première preuve directe que déméthylases histones jouent un rôle essentiel dans la reprogrammation de cellules somatiques. Comment Li régule le niveau de LSD1 est pas encore clair. Il semble que l'effet de Li sur LSD1 passe pas par la GSK3, comme CHIR99021 n'a pas affecté le niveau LSD1 dans MEF. Que Li vise LSD1 reste directement ou par d'autres voies à élucider. Autres objectifs déclarés de Li, y compris IMPase, p53 et Bcl-2 ne sont pas impliqués dans la mise en valeur de Li de reprogrammation. Li a également été proposé pour moduler les voies métaboliques et / ou des systèmes de compensation de la protéine, et modifier les organites cellulaires, principalement des mitochondries et ER 33. Les mitochondries sont le centre de régulation de l'énergie de la cellule et, récemment, une petite molécule de régulation de la glycolyse a été rapportées pour faciliter COPSi génération en combinaison avec Oct4 et autres produits chimiques 13. Savoir si Li améliore la reprogrammation par des voies métaboliques est encore incertain. Nos données indiquent également un effet synergique de Li et Vc et le mécanisme reste également à élucider. Il est également intéressant de noter que Li, Vc et APV ont tous été rapportés d'avoir effet anti-vieillissement, et tous les trois ont un tel effet puissant sur la reprogrammation. Nos résultats ont non seulement fourni un outil utile pour aider à générer iPSC de haute qualité et disséquer les mécanismes sous-jacents, mais aussi stimuler la recherche dans le domaine de souches in vivo réglementation et le vieillissement cellulaire. Matériels et méthodes Dérivation de MEF et de la culture cellulaire OG2 souris, qui portent l'allèle Rosa26-lacZ et un promoteur de Oct4 transgénique entraînement expression de la GFP 8, 34, ont été accouplées avec des souris et 129 cellules MEF ont été isolés à partir d'embryons E13.5 d'hétérozygotes pour l'allèle transgénique Oct4-GFP. Gonades et les organes internes ont été enlevés avant le traitement pour l'isolement de cellules MEF. MEF ont été cultivées dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 2 mM de L-glutamax, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels (NEAA), 100 unités / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. Cellules MEF isolés dans les premiers passages (passage jusqu'à trois) ont été utilisés pour d'autres expériences. Génération souris iPSC Rétrovirus ont été produites par transfection de cellules avec plate-E pMXs vecteurs rétroviraux contenant les séquences codantes de souris Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc (obtenu à partir de Addgene). MEF ont été ensemencées à une densité de 150 000 cellules par puits dans six puits plaque 18 h avant l'infection. Virus surnageants contenant, additionné de 4 ug / ml de polybrène, on a ajouté sur les plaques de cultures de cellules MEF et deux épines à 500 tours par minute pendant 90 min pour garantir leur infection. Le milieu a été changé immédiatement après la transduction du virus et ce jour est compté comme "Jour 0".

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Published by Jean-Pierre LABLANCHY - CHRONIMED - dans Concept
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