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9 avril 2011 6 09 /04 /avril /2011 10:12

Applications de l’ADN nu ou associé à des liposomes en thérapie génique anticancéreuse. Intérêt des méthodes de transfert de gène non virales, et particulièrement de l’ADN nu ou de l’ADN en association avec des liposomes (lipoplexes) dans la thérapie génique

 

Samuel Bertin, Silvia Neves, Maria Pedroso de Lima, Valérie Pierrefite-Carle , Université de Nice Sophia-Antipolis, Faculté de médecine, Inserm U638, Université de Nice Sophia Antipolis, avenue de Valombrose, 06107 Nice Cedex 2, Department of Biochemistry, Apartado 3126 and Cent, Center for neuroscience and cell biology, University of Coimbra, 3001-401, Coimbra, Portugal.

           

Résumé :

En dépit des grandes espérances associées à la thérapie génique, son application chez l’homme reste entravée par l’incapacité de délivrer efficacement et sans risque le gène d’intérêt au tissu cible.

Les effets indésirables graves observés dans des essais cliniques utilisant des vecteurs viraux ont renouvelé l’intérêt pour les méthodes non virales, la sécurité associée à ces méthodes apparaissant comme un atout prépondérant.

Ces vecteurs sont caractérisés par une faible toxicité, une faible immunogénicité ainsi qu’une production aisée et économique.

Leurs principaux inconvénients sont la faible efficacité de transfert de gène obtenue et le caractère transitoire de l’expression du transgène.

Dans ce contexte, le cancer apparaît comme une pathologie de choix pour l’utilisation de ces vecteurs car une expression prolongée du gène thérapeutique n’est pas toujours requise et la faible efficacité du transfert de gène peut être compensée, dans certaines approches, par un relais du système immunitaire et/ou une toxicité de voisinage.

Cet article de synthèse présente l’intérêt des méthodes de transfert de gène non virales, et particulièrement de l’ADN nu ou de l’ADN en association avec des liposomes (lipoplexes) dans la thérapie génique anticancéreuse

 

ARTICLE

 

La thérapie génique repose sur le concept d’ADN-médicament. Tout d’abord développée pour traiter les maladies monogéniques, cette stratégie a par la suite trouvé un large champ d’application dans diverses maladies acquises, en particulier dans le domaine du cancer. À ce jour, l’immunothérapie génique, la thérapie génique utilisant les gènes suppresseurs de tumeur et la thérapie génique suicide représentent environ 50 % des stratégies utilisées en clinique [1]. Les deux premières approches visent respectivement à stimuler le système immunitaire [2] et à restaurer un phénotype normal [3]. La thérapie génique suicide consiste à transférer dans les cellules tumorales un gène viral ou bactérien, appelé gène suicide, dont le produit est capable de convertir un promédicament non toxique en drogue toxique.Aujourd’hui, l’enjeu de la thérapie génique repose essentiellement sur le développement de vecteurs : idéalement, ces systèmes de transfert de gène doivent être sûrs, efficaces, spécifiques à un type cellulaire et capables de fonctionner dans des cellules, qu’elles se divisent ou non, en assurant une expression stable du gène thérapeutique. De plus, leur production industrielle doit être fiable et rentable. À ce jour, aucun vecteur connu ne remplit complètement ce lourd cahier des charges. Ainsi, en dépit des grandes espérances associées à la thérapie génique, son application chez l’homme reste entravée par l’incapacité de délivrer efficacement et sans risque le gène d’intérêt au tissu cible.Il existe actuellement deux grandes familles de vecteurs : les vecteurs viraux et les vecteurs non viraux. Les virus sont des vecteurs naturels capables de transférer leur information génétique dans une cellule. De nombreux virus ont donc fait l’objet d’une adaptation en vecteurs et, actuellement, environ deux protocoles sur trois utilisent des vecteurs viraux. Cependant, bien que les vecteurs viraux permettent une bonne efficacité de transfert de gène, ils présentent néanmoins certains inconvénients. En effet, leur utilisation chez l’homme soulève, malgré tout, des problèmes de sécurité non négligeables liés à une potentielle mutagenèse insertionnelle, à une éventuelle toxicité résiduelle ou à une réponse immunitaire exacerbée. De plus, la production de certains d’entre eux à grande échelle reste coûteuse et difficile.Dans le cadre des méthodes non virales de transfert de gène, l’ADN peut être administré seul (ADN nu) ou son entrée dans les cellules peut être facilitée en utilisant des vecteurs physiques (bombardement particulaire, électroporation, ultrasons, etc.) ou chimiques (liposomes, polymères cationiques, conjugués moléculaires, etc.). Les vecteurs non viraux sont caractérisés par une faible immunogénicité qui laisse envisager la possibilité d’administrations répétées, une faible toxicité, ainsi qu’une production aisée et économique. Les principaux inconvénients de ces vecteurs sont la faible efficacité de transfert de gène obtenue et le caractère transitoire de l’expression du transgène.Dans cette revue, nous nous limiterons à la description des travaux réalisés par utilisation d’ADN nu ou complexé à des liposomes.

 

L’ADN nu

Caractéristiques du transfert de gène par injection d’ADN nu

 

Wolff et al. [4] ont été les premiers à démontrer en 1990 que l’expression d’un gène pouvait être obtenue dans le muscle strié de souris par simple injection directe d’ADN plasmidique et ce, quel que soit le gène rapporteur utilisé (chloramphénicol, acétyltransférase, luciférase et β-galactosidase). De plus, cette expression restait détectable dans les cellules musculaires pendant plus de 2 mois. Suite à cette étude, de nombreux travaux ont permis de caractériser le transfert de gène obtenu par cette technique simple. Le gène transféré est généralement porté par un plasmide bactérien dans lequel le transgène est placé sous le contrôle de différents éléments de régulation eucaryotes. Bien que le principal inconvénient de l’ADN nu soit la faible efficacité de transfert de gène, celle-ci est néanmoins suffisante dans certains cas pour obtenir l’effet thérapeutique souhaité. Ainsi, en thérapie génique du cancer, le transfert d’un gène dont le produit déclenche une toxicité de voisinage (gènes suicides) ou une réponse immune antitumorale permet d’obtenir un effet thérapeutique significatif malgré une efficacité de transfert de gène modeste [5-7]. Par ailleurs, l’ADN plasmidique ne s’intègre pas dans les chromosomes de la cellule hôte et reste sous forme d’épisome dans le noyau, évitant tout risque de mutagenèse insertionnelle. Après injection intratissulaire et pénétration au sein de la cellule hôte, il est dégradé progressivement, principalement dans les endosomes et les lysosomes, par les nucléases endogènes, ce qui explique le caractère transitoire de son expression [8]. L’administration in vivo d’ADN nu par voie systémique est suivie d’une rapide dégradation par les nucléases du sérum et la phagocytose par le système réticulo-endothélial, principalement les cellules hépatiques de Kupffer [9]. Par ailleurs, la sécurité de la thérapie génique dépend également de la restriction d’expression du transgène au tissu ciblé.

En dépit d’un certain nombre de publications concernant la biodistribution d’ADN nu injecté par voie intravasculaire ou intramusculaire, peu d’informations sont disponibles en ce qui concerne le mode d’injection intratumoral. Néanmoins, une étude de biodistribution chez la souris comparant injection intramusculaire et injection intratumorale a permis de montrer que l’ADN plasmidique reste principalement localisé sur le site d’injection lorsqu’il est injecté par voie intratumorale alors qu’une diffusion plus importante est observée lorsqu’il est injecté en intramusculaire. Ainsi, après injection intramusculaire et également, bien qu’à moindre mesure, après injection intratumorale, la présence de l’ADN plasmidique radiomarqué a été détectée dans la circulation systémique, dans les ganglions lymphatiques drainant le site d’injection ainsi que dans certains organes (foie, reins et rate notamment). Dans les deux types d’injection, approximativement 25 et 5 % de la dose injectée sont encore détectables respectivement 3 et 9 heures après l’injection [10].

 

Travaux précliniques réalisés par injection d’ADN nu

Bien que le muscle apparaisse comme un organe privilégié pour l’injection d’ADN nu, tant pour l’efficacité de transfert de gène que pour la durée d’expression du transgène, différents tissus ont, suite aux travaux de Wolff et al., été « transfectés » par cette technique, tels que, par exemple, le muscle cardiaque [11], le foie [12], la vessie, les reins et les testicules [13]. Par ailleurs, différents modèles de tumeur ont également été transfectés par injection directe d’ADN nu avec des effets thérapeutiques significatifs. Ainsi, dans des modèles sous-cutanés de cancer du côlon, de vessie et de fibrosarcome chez la souris, l’injection intratumorale d’un plasmide exprimant le gène codant pour l’IFNγ induit une expression significative du transgène et une régression complète des tumeurs chez 33 % des souris traitées [14]. Étant donné la faible efficacité de transfert de gène obtenue par injection d’ADN nu, les résultats les plus significatifs en termes d’efficacité thérapeutique ont été observés lors du transfert d’un gène capable de générer une toxicité de voisinage. Cet effet induit la destruction des cellules tumorales sauvages situées à proximité des cellules tumorales exprimant le gène thérapeutique même si ces dernières ne représentent que 10 % des cellules tumorales [7]. Ainsi, nous avons pu montrer, dans un modèle de métastases hépatiques chez le rat, que l’injection intratumorale d’un plasmide exprimant le gène suicide cytosine désaminase (CD) suivie d’un traitement par la prodrogue 5-fluorocytosine (5FC) conduisait à une régression de 67 % du volume de la tumeur injectée. Cet effet s’explique par la conversion in situ de 5FC en 5-fluoro-uracile (5FU) et par la diffusion de cette drogue cytotoxique des cellules transfectées vers les cellules adjacentes [5]. De la même manière, dans un modèle de cancer de la thyroïde chez la souris, l’injection intratumorale d’un plasmide possédant le gène codant pour l’oxyde nitrique synthase II (NOS II) permet une régression de 35 % du volume des tumeurs via la diffusion d’oxyde nitrique, malgré une faible efficacité de transfert de gène [6].

Outre les approches consistant à transférer un gène thérapeutique, l’injection d’ADN nu a également trouvé un large champ d’application dans les stratégies de vaccination. En raison d’une expression prolongée du transgène après injection intramusculaire, cette voie d’administration est très utilisée dans des protocoles de vaccination utilisant des antigènes tumoraux. Les cellules dendritiques présentes dans le tissu cible de la vaccination peuvent alors être directement transfectées ou capturer l’antigène tumoral produit par les cellules transfectées, conduisant ainsi à une présentation dans le contexte du complexe majeur d’histocompatibilité de classes I et II. La vaccination par injection d’ADN nu codant pour des antigènes tumoraux permet d’induire une réponse cellulaire (lymphocytes T-CD4) et cytotoxique (lymphocytes T-CD8) et humorale se traduisant généralement par une inhibition de la croissance tumorale. De plus, les réponses obtenues peuvent êtres potentialisées en coadministrant un gène codant pour une cytokine, telle que l’IFNγ, l’IL12 ou encore le GM-CSF [15].

 

Mécanismes d’entrée de l’ADN nu

Les mécanismes permettant à l’ADN d’entrer dans les cellules in vivo sont encore inconnus. L’internalisation des molécules d’ADN est un processus relativement rapide. En effet, un ADN plasmidique radiomarqué est détectable dans les cellules tumorales dès 10 minutes après son injection dans la tumeur. Par ailleurs, il semble que la nature du tissu cible influence l’efficacité de transfert de gène, l’expression du transgène étant par exemple 100 fois plus faible dans un modèle de tumeur colique sous-cutanée que dans le muscle chez la souris [10]. Parmi les hypothèses avancées concernant le mécanisme d’entrée, un rôle de l’augmentation de pression et l’existence d’un mécanisme actif sont à ce jour privilégiés [9, 16, 17]. Une augmentation de pression accompagne une injection plasmidique par voie vasculaire ou tissulaire [9]. Un stress compressif est observé dans les deux cas. Une diminution du volume injecté ou une augmentation du temps d’injection se traduit généralement par une diminution d’expression du transgène, suggérant que l’augmentation de pression est un paramètre important pour la pénétration de l’ADN in vivo [9]. Par ailleurs, l’internalisation d’un plasmide après injection intratumorale ou intramusculaire est un processus saturable, car inhibé lors de l’injection simultanée d’autres polyanions, tels que le dextran sulfate [10]. Des études réalisées avec des oligodéoxynucléotides synthétiques (ODN) ont permis de conforter l’hypothèse d’un mécanisme saturable, température, temps et énergie-dépendant [16]. Ainsi, à ce jour, l’hypothèse la plus vraisemblable est celle qui rend compte de l’existence de ces deux mécanismes : l’ADN serait internalisé par un processus d’endocytose médiée par un récepteur en conditions physiologiques normales mais il pourrait également diffuser à travers la membrane plasmique lorsqu’un stress osmotique est généré pendant l’injection.

Bien que le récepteur impliqué reste à ce jour inconnu, plusieurs protéines ont été identifiées comme jouant potentiellement un rôle dans ce processus. Ainsi, dans les kératinocytes, l’ezrin et la moesin ont été impliquées dans l’entrée et le trafic de l’ADN nu in vivo [18]. Ces protéines, qui ne présentent pas de portion transmembranaire, sont connues pour leur rôle de liaison entre la membrane et le cytosquelette via leur association à des récepteurs transmembranaires. Une autre étude propose le lipopolysaccharide (LPS), présent à l’état résiduel dans les préparations d’ADN plasmidique, comme facilitant l’entrée de l’ADN via une association physique non covalente entre l’ADN et le LPS [19]. Les complexes ADN-LPS ainsi formés, injectés en intra-articulaire, sont reconnus par une protéine de liaison du LPS, la protéine MD2, qui va faciliter l’entrée de l’ADN principalement dans les synoviocytes de type fibroblastique. Néanmoins, cette facilitation de l’entrée de l’ADN pourrait être spécifique d’un tissu et/ou d’un type cellulaire donné. En effet, chez des souris knockout pour le gène md2, alors que l’efficacité de transfection dans le tissu synovial est significativement diminuée, celle-ci reste en revanche inchangée suite à une injection intramusculaire, suggérant un mécanisme différent d’internalisation de l’ADN dans le muscle squelettique.

 

Rôle des séquences CpG bactériennes

Les séquences CpG sont fréquentes et non méthylées dans l’ADN bactérien alors qu’elles sont peu fréquentes et très majoritairement méthylées dans les génomes de mammifères. Ces différences ont conduit le système immunitaire à reconnaître les séquences CpG bactériennes comme un signal de danger traduisant une infection. Après reconnaissance par les cellules du système immunitaire (lymphocytes B, monocytes, macrophages, cellules dendritiques et neutrophiles) exprimant le récepteur intracellulaire Toll-like receptor 9 (TLR9), les motifs CpG non méthylés activent diverses voies de signalisation (ERK, p38, PKC…) et induisent notamment la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (IFNα, IFNγ, TNFα, IL1β, IL6, IL8, IL12, IL18…) et de chimiokines (MIP1α/β, MIP2, RANTES, MCP1, IP10…) [20]. De ce fait, les séquences CpG non méthylées confèrent aux plasmides bactériens des propriétés pro-inflammatoires qui peuvent potentialiser la réponse immune antitumorale. Ainsi, l’injection intratumorale d’ODN CpG permet d’induire la régression des lésions traitées dans différents modèles de cancer chez la souris [20]. Par ailleurs, l’injection intradermique d’un plasmide génère une réponse inflammatoire dépendante des motifs CpG et indépendante de la présence d’un transgène [21] et induit le recrutement de lymphocytes dans les ganglions drainants [22]. Par ailleurs, des travaux récents indiquent que différentes lignées de cellules tumorales expriment le TLR9 [23] et que des ODN CpG sont capables d’induire des effets antiprolifératifs et pro-apoptotiques sur ces cellules in vitro par un mécanisme restant à identifier [24, 25]. Ainsi, les séquences CpG bactériennes fonctionnent comme un immunogène intrinsèque au vecteur plasmidique, puisqu’elles sont capables à elles seules dans différents types de tumeurs, de déclencher les événements cellulaires et moléculaires nécessaires à la mise en place d’une réponse immune antitumorale efficace.

 

Utilisation clinique de l’ADN nu

 

L’utilisation d’ADN nu représente en 2006 17 % de tous les essais, toutes applications confondues [1]. À ce jour, 192 essais cliniques de thérapie génique par injection d’ADN nu ont été réalisés ou sont en cours de réalisation dans le monde et environ 2 essais sur 3 concernent le cancer [1]. Les caractéristiques des principaux essais de thérapie génique par injection in vivo d’ADN nu sont résumées dans le tableau 1. Dans un protocole de thérapie génique suicide de phase I, 12 patientes présentant des métastases cutanées de cancer du sein ont reçu une injection intramétastatique d’un plasmide contenant le gène CD sous le contrôle du promoteur erb2, permettant ainsi la conversion de la prodrogue 5FC en 5FU dans les cellules tumorales erb2 positives. Cette étude a démontré une expression du gène CD restreinte aux cellules tumorales erb2 positives chez 11 des 12 patientes et l’absence de toxicité relative à l’injection du plasmide [26]. Au cours d’un essai de phase I d’immunothérapie génique, Heinzerling et al. [27] ont montré que des injections intratumorales répétées d’un plasmide exprimant le gène de l’IL12 chez 9 patients atteints d’un mélanome malin sont bien tolérées et permettent une stabilisation de la maladie et une rémission complète chez deux patients. Dans le cadre d’un protocole de transfert de gène suppresseur de tumeur, Habib et al. [28] ont traité 5 patients présentant un carcinome hépatocellulaire par une injection intratumorale percutanée d’un plasmide exprimant le gène p53. Suite à ce traitement, une réponse objective, maintenue entre 2 et 9 mois, a été observée chez 3 patients sur 5. Ainsi, les essais dont les résultats sont publiés à ce jour permettent de conclure à la faisabilité et à l’innocuité de cette approche. Néanmoins, la plupart des études réalisées portent sur un très faible nombre de patients et ne permettent généralement pas de conclure à l’efficacité de la stratégie utilisée (essais de phase I essentiellement).

Tableau 1 Principaux essais de thérapie génique par injection in vivo d’ADN nuLes essais cliniques répertoriés sur le site Wiley [1] utilisant un transfert de gène par injection d’ADN nu sont présentés. Le mode d’administration est l’injection intratumorale. Les essais de vaccination ne sont pas présentés. CD : cytosine désaminase ; EGFR : epithelial growth factor receptor ; IFN : interféron ; IL : interleukine ; LacZ : gène codant pour l’enzyme β-galactosidase ; p53 : gène suppresseur de tumeur codant pour la protéine p53

 

 

Les liposomes

Les liposomes sont les vecteurs non viraux les plus utilisés actuellement en thérapie génique. Ce sont des vésicules sphériques composées d’une bicouche lipidique synthétique, mimant la structure des membranes et capables de véhiculer de l’ADN. Leur association à l’ADN permet de protéger ce dernier de l’action des nucléases et de le compacter par neutralisation de charges. L’utilisation de liposomes cationiques permet également, après injection intratumorale, une plus grande rétention dans la tumeur de l’ADN plasmidique associé [10]. Cette approche offre par ailleurs la possibilité de ciblage par addition de ligands dont le récepteur spécifique est présent sur les cellules cibles. Ainsi, l’utilisation de liposomes permet d’augmenter l’efficacité de transfert de gène tout en conservant la plupart des avantages liés à l’utilisation d’ADN nu.

Structures des liposomes et des lipoplexes

Les liposomes les plus utilisés en thérapie génique sont des liposomes cationiques. Depuis leur première utilisation [29], les formulations à base de lipides cationiques n’ont cessé de se multiplier pour devenir, actuellement, l’alternative la plus étudiée à l’emploi des vecteurs viraux. Les liposomes cationiques sont des molécules amphiphiles comportant une chaîne hydrophobe (acides gras essentiellement) attachée par un « espaceur » à une tête polaire hydrophile chargée positivement (mono ou multicationique) qui leur permet d’interagir avec les molécules d’ADN chargées négativement [30]

Les têtes polaires multicationiques (Dospa, Dogs) sont plus efficaces pour condenser et protéger l’ADN et sont donc plus actives que les lipides monocationiques (Dotma, Dotap, DC-chol) [31]. Néanmoins, une progressive augmentation des charges positives produit une trop forte interaction avec l’ADN, ce qui peut, à terme, empêcher la dissociation du complexe dans la cellule. La chaîne hydrophobe peut être composée de deux chaînes aliphatiques généralement insaturées et longues d’au moins 12 atomes de carbone ou bien un dérivé de cholestérol. En général, l’efficacité de transfection augmente avec la longueur de la chaîne aliphatique et sa saturation. La nature du groupe de liaison qui relie la partie hydrophobe à la tête polaire a été corrélée à l’efficacité de transfection mais aussi à la toxicité des liposomes cationiques [32]. En effet, les lipides qui contiennent une liaison éther stable (Dotma, DMRIE) sont plus toxiques car moins biodégradables que ceux qui ont une liaison éther plus faible (Dotap). En revanche, l’incorporation d’une liaison peu stable peut conduire à une dégradation dans les fluides biologiques. Il faut donc trouver un compromis entre stabilité et toxicité [33]. L’efficacité de transfection est augmentée par l’addition de lipides neutres (Dope et cholestérol) promoteurs de la fusion dont on pense qu’ils aident à la désorganisation de l’endosome. La cytotoxicité des complexes liposomiques varie avec la concentration en lipides, le temps d’exposition et le type cellulaire.

Les connaissances acquises lors de l’étude et de l’utilisation des formulations les plus anciennes ont été mises à profit pour synthétiser de nouveaux composés (dérivés aliphatiques ou dérivés de cholestérol) qui présentent une meilleure efficacité de transfection. L’interaction entre liposomes et ADN conduit à la formation d’un complexe appelé lipoplexe. En fonction de différents paramètres, trois types de structure de lipoplexe peuvent être obtenus. Le première correspond à des micelles renfermant l’ADN, le deuxième est constitué de couches superposées de lipides et d’ADN et le dernier correspond à des structures mixtes circulaires et longitudinales [34, 35] (figure 2). Ces trois types de structure peuvent coexister dans une préparation ou, alternativement, l’une d’entre elles peut être prépondérante. Lorsque l’on utilise des lipides cationiques, le rapport lipide/ADN et la concentration totale en lipides sont des facteurs critiques pour la réussite d’une transfection.

Mécanismes d’interaction des lipoplexes avec les cellules

Lors d’un transfert de gène non viral, le complexe ADN/vecteur, injecté dans l’organisme, doit circuler sans être dégradé jusqu’aux cellules cibles. Arrivé à proximité des cellules, il doit sortir du compartiment sanguin et entrer en contact avec les membranes des cellules cibles. L’ADN doit ensuite pénétrer dans la cellule, diffuser dans le cytoplasme sans y être dégradé, traverser l’enveloppe nucléaire et s’exprimer. Ces étapes constituent des obstacles limitant l’efficacité du transfert de gène.

 

Association cellule-lipoplexes

 

Les lipoplexes qui conservent une charge positive génèrent généralement les meilleurs niveaux de transfection. Cette observation a suggéré un rôle des protéoglicanes sulfatés associés à la membrane. Ces molécules sont des protéines possédant des glycosaminoglicanes polysulfatés, présentes dans la membrane et chargées négativement [37]. Leur rôle précis est à ce jour encore controversé.

 

Internalisation des lipoplexes

 

Les mécanismes d’entrée du complexe ADN plasmidique/lipides cationiques sont peu connus, mais plusieurs observations tendent à démontrer que les complexes entrent dans la cellule par endocytose, ces observations n’excluant pas qu’une partie des complexes puisse entrer directement par passage à travers la membrane plasmique ou par d’autres processus comme la phagocytose lorsque les complexes présentent des tailles supérieures à 200 nm. Par ailleurs, même si la majorité des complexes entrent dans la cellule par endocytose, il n’est pas prouvé que l’ADN qui s’exprime dans la cellule ne provienne pas de la fraction des complexes qui sont entrés par passage direct à travers la membrane. Enfin, il est possible d’associer des ligands tels que la transferrine, dont le récepteur est surexprimé par une majorité de cellules cancéreuses, pour permettre un traitement ciblé et augmenter l’internalisation des lipoplexes [38].

 

Relargage dans de cytoplasme

 

Après internalisation, le relargage des complexes de l’endosome vers le cytoplasme est crucial afin d’éviter la dégradation de l’ADN au niveau des lysosomes. Des études mécanistiques suggèrent que la présence des liposomes cationiques induit une déstabilisation de la membrane de l’endosome via le flip-flop des lipides anioniques entre la face cytoplasmique et luminale de l’endosome. La formation d’interactions ioniques entre les lipides cationiques des liposomes et les lipides anioniques de l’endosome induit le déplacement de l’ADN des complexes et son relargage dans le cytoplasme [39]. Plusieurs stratégies peuvent être utilisées pour augmenter l’efficacité de cette étape. Le phospholipide diolèoylphosphatidylèthanolamine (Dope) est un lipide neutre connu pour stabiliser les liposomes cationiques et qui a un rôle très important dans la déstabilisation de la membrane de l’endosome une fois que l’acidification de l’endosome active ses propriétés fusogèniques. On peut également associer aux lipoplexes des peptides fusogèniques sensibles au pH, similaires à ceux qui existent dans certaines enveloppes virales, qui possèdent une activité de lyse des endosomes [40].

 

Trafic nucléaire de l’ADN

 

Une fois dans le cytoplasme, l’ADN doit atteindre le noyau et passer la membrane nucléaire. Dans les cellules qui se divisent activement, l’entrée de l’ADN est facilitée par le désassemblage de la membrane nucléaire qui se produit lors de la mitose. En l’absence de division cellulaire, le mécanisme par lequel l’ADN entre dans le noyau est à ce jour inconnu. L’entrée de l’ADN dans le noyau par diffusion passive est exclue du fait de sa taille, mais l’ADN pourrait être internalisé par un processus actif après association non spécifique à des protéines navettes contenant des signaux de localisation nucléaire (NLS). Une stratégie visant à augmenter la quantité d’ADN internalisé dans le noyau consiste à coupler aux molécules d’ADN des peptides contenant un signal NLS, tel que le peptide NLS de la protéine virale tat VIH1 [41].

 

Les nouveaux défis des vecteurs lipidiques

 

L’un des principaux problèmes rencontrés lors de l’utilisation des liposomes in vivo est l’interaction non spécifique des lipoplexes avec des cellules telles que les érythrocytes, les lymphocytes et les cellules endothéliales ou encore avec des protéines telles que les protéines de la matrice extracellulaire et les protéines sériques [42, 43]. Ces interactions favorisent la dissociation des complexes et diminuent le relargage de l’ADN dans les cellules. Elles peuvent également conduire à la formation d’agrégats qui peuvent s’arrêter au niveau de certains organes, comme le cœur ou les poumons, ou être éliminés de la circulation par des macrophages [44]. Plusieurs solutions visant à diminuer ces interactions sont utilisables. In vivo, les lipoplexes contenant du cholestérol sont moins inactivés par la présence de sérum et donc plus stables en milieu physiologique, car ce lipide inhibe la fixation des protéines sériques. Une autre solution est d’utiliser des liposomes cationiques modifiés, contenant un phospholipide dérivant du polymère polyéthylène glycol (PEG). Cette stratégie augmente le temps de circulation des complexes et leur permet d’atteindre des tissus cibles comme les tumeurs au lieu de rester piégés au niveau des poumons ou du cœur [45]. Il est également possible, en utilisant cette approche, de conjuguer les molécules de PEG avec des anticorps spécifiques afin de réaliser un ciblage [46]. Cependant, l’addition de PEG peut diminuer l’efficacité de transfert de gène [47]. Une alternative permettant d’augmenter la stabilité colloïdale des liposomes et d’éviter leur inhibition par le sérum est d’ajouter dans les complexes des peptides fusogéniques ou encore des protéines chargées négativement comme par exemple l’albumine humaine [48] ou la transferrine [38]. Enfin, une dernière possibilité consiste à encapsuler de l’ADN précondensé par des agents tels que la polylysine (PLL) ou le polyéthylénimine (PEI) dans des liposomes neutres ou chargés négativement qui interagissent moins avec les cellules que les liposomes cationiques, permettant ainsi un temps de circulation plus long [49].

Ce type de liposomes a, de plus, grâce à sa structure, l’avantage de pouvoir être optimisé plus facilement pour un ciblage actif. Néanmoins, un faible taux d’encapsulation de l’ADN, une internalisation par les cellules peu efficace et un mode de préparation plus difficile sont des inconvénients non négligeables liés à l’utilisation de ce type de liposomes. Le second problème rencontré avec l’utilisation des liposomes est lié à leur taille, en particulier lors d’une administration systémique. Les agents condensants (PEI, PLL), utilisés pour la préparation de liposomes neutres ou chargés négativement, peuvent également être employés pour condenser l’ADN avant sa complexation avec les lipides cationiques. Cette approche a donné des résultats prometteurs en termes de taille des particules, résistance aux nucléases et efficacité de transfection [49]. Fahr et al. [50] ont mis au point un nouveau type de vecteur liposomal appelé artificial virus-like particle. La composition lipidique de ce vecteur mime celle des rétrovirus et l’ADN est condensé avec du PEI branché de faible poids moléculaire. Le résultat est une particule capable de condenser l’ADN, pourvue de propriétés endosomolitiques, avec une petite taille et une charge superficielle négative. Ces caractéristiques conduisent à une absence de toxicité et à une réduction des interactions avec les milieux biologiques. Il est également possible d’équiper ces particules de peptides qui facilitent le ciblage vers un type cellulaire spécifique. Il est en effet possible d’associer un peptide cyclique Arg-Gly-Asp pour cibler des tumeurs endothéliales et des cellules de mélanome qui expriment de hauts niveaux de l’intégrine αvβ3[50]. Ces stratégies, visant à attribuer des caractéristiques virales aux liposomes, en associant des protéines ou des peptides viraux pour augmenter leur efficacité de transfection, peuvent néanmoins limiter leur production à grande échelle et les rendre immunogènes.

 

Utilisation clinique des lipoplexes

 

Les liposomes cationiques sont, parmi les vecteurs non viraux, les plus utilisés dans les essais cliniques au niveau mondial.

Récemment, dans le cadre d’un protocole d’immunothérapie génique, Yoshida et al. [51] ont transféré le gène IFNβ complexé à des liposomes cationiques chez des patients présentant un glioblastome. Un effet antitumoral a été observé chez 4 des 5 patients traités, avec une réponse objective maintenue pendant 16 semaines chez 2 patients et une stabilisation de la maladie chez 2 autres. En 1993, Nabel et al. [52] ont injecté des lipoplexes contenant le gène codant pour l’antigène HLA-B7 dans des nodules cutanés chez 5 patients HLA-B7-négatifs atteints d’un mélanome métastasé. Une réponse T cytotoxique et un effet antitumoral ont été observés chez l’ensemble des patients. Chez l’un d’entre eux, 2 nodules injectés ainsi que d’autres métastases non traitées ont totalement régressé. Depuis cet essai encourageant, de nombreux protocoles ont été mis en place, utilisant principalement la formulation Allovectin® (Vical Inc.) constituée du plasmide codant pour HLA-B7 complexé avec des liposomes cationiques DMRIE-Dope.

Dans le contexte d’inactivation d’oncogènes, des études précliniques ont montré que le gène E1A de l’adénovirus de type 5 a une activité antitumorale associée à la répression transcriptionnelle de l’oncogène HER2/neu qui est surexprimé dans un certain nombre de tumeurs, principalement du sein et de l’ovaire. Dans ce cadre, Hortobagyi et al. [53] ont évalué l’efficacité de l’injection intrapéritonéale ou intrathoracique du gène E1A complexé à des liposomes cationiques constitués de DC-Chol chez des patientes présentant un cancer du sein ou de l’ovaire. Suite au traitement, les auteurs ont observé une diminution significative de l’expression du gène HER2/neu dans les tumeurs, accompagnée d’une induction de l’apoptose et d’une réduction de la prolifération des tumeurs. Lors d’un essai de phases I-II, Voges et al. [54] ont traité 8 patients présentant un glioblastome par une injection stéréotaxique de liposomes cationiques contenant le gène suicide thymidine kinase (TK) du virus Herpès simplex de type 1 (HSV1) suivie de l’administration systémique de la prodrogue ganciclovir. Le traitement a été très bien toléré, sans effet secondaire majeur, et une réduction de plus de 50 % du volume de la tumeur a été observée chez 6 des 8 patients.
Tableau 2 Principaux essais de thérapie génique par injection in vivo d’ADN complexé à des liposomes [1]. IFN : interféron ; HLA : human leucocyte antigen ; HSV-TK : thymidine kinase du virus Herpès simplex de type 1 ; DMRIE : (±)-N-(2-hydroxyéthyl)-N, N-diméthyl-2,3-bis (tétradecyloxy)-1-propanaminium bromide ; Dope : 1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine ; E1A : adenovirus type 5 early region 1 ; DC-Chol : 3 bêta (N (N’, N-diméthylaminoéthane) carbamoyl) cholestérol

 

Conclusion

Parmi les multiples avantages des méthodes non virales de transfert de gène, la sécurité apparaît comme un atout prépondérant dans le cadre d’une utilisation chez l’homme.

Les deux inconvénients majeurs de ces méthodes sont la faible efficacité de transfert de gène et le caractère transitoire de l’expression du transgène.

Dans ce contexte, le cancer apparaît comme une pathologie de choix pour l’utilisation de ces vecteurs car une expression prolongée du gène thérapeutique n’est pas toujours requise et la faible efficacité de transfert de gène peut être compensée, dans certaines approches, par un relais du système immunitaire et/ou une toxicité de voisinage.

La plus simple des techniques non virales consiste à utiliser l’ADN nu. Les connaissances concernant l’administration d’ADN in vivo ont largement évolué depuis les travaux de Wolff et al. en 1990 [4] et l’identification des séquences CpG non méthylées en 1995 [20].

En 15 ans, l’ADN est passé du statut de molécule « inerte », support de l’information génétique, à celui de molécule activatrice de voie de signalisation, capable de pénétrer dans les cellules in vivo et dotée de propriétés immunostimulantes.

 

Cependant, des travaux concernant le mécanisme d’entrée dans les cellules in vivo, en particulier l’identification d’un ou plusieurs récepteurs, sont encore nécessaires afin d’améliorer le transfert de gène et/ou de cibler certains tissus dans lesquels ce processus d’entrée est efficace.

 

L’utilisation de complexes ADN-liposomes permet de conserver les propriétés de l’ADN nu tout en augmentant de façon significative l’efficacité de transfert de gène.

 

Grâce à leur sécurité et à leur versatilité, les liposomes cationiques s’avèrent être une alternative viable à l’utilisation des vecteurs viraux.

Le vecteur idéal doit être de petite taille et homogène, présentant une charge superficielle neutre ou négative pour éviter les interactions non spécifiques avec les composants du sang. Il doit aussi pouvoir assurer la protection de l’ADN, permettre un ciblage spécifique au tissu cible, l’entrée du gène dans la cellule et sa translocation dans le noyau.

De nombreux paramètres tels que la composition des liposomes, le ratio lipides/ADN, l’ordre d’addition des composants ou le milieu vont moduler les propriétés physicochimiques des liposomes comme la taille, la charge, la stabilité et l’interaction avec les cellules.

La manipulation de ces propriétés permet de construire des lipoplexes spécifiques pour chaque application (in vitro, in vivo, ex vivo), chaque protocole ou mêmes voies d’administration.

Des études concernant les mécanismes impliqués dans la formation des liposomes, l’entrée de l’ADN et le moyen de franchir les barrières biologiques sont à poursuivre pour faire évoluer ce domaine d’application qui fera très certainement partie des thérapies anticancéreuses de demain.

 

 

 

 

Bulletin du Cancer. Volume 94, Numéro 3, 243-52, Mars 2007, Synthèse

 

 

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Published by chronimed - dans Concept
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